家蚕微粒子检测新方法的探索

邹邦兴 周安莲 肖文福 张友洪 肖金树

家蚕微粒子检测新方法的探索

邹邦兴 周安莲 肖文福 张友洪 肖金树

（四川省农业科学院蚕业研究所，四川 南充 637000）

目前，蚕种质检单位在微粒子检测上都沿用巴斯德提出的母蛾显微镜检法，而该方法的使用在很大程度上取决于镜检人员的操作技能、专业判断、业务素质及设备情况，其检测结果与人员的操作息息相关。因此，当下能否找到一种实用、简单、对人员要求低、高效快速的新方法值得蚕业工作者去探索。

蚕种 微粒子检测 方法

蚕桑行业在我国有着几千年的历史底蕴，封建社会时期栽桑养蚕成为养蚕农家的主要经济来源，然而随着现代经济的快速发展，我国的蚕桑行业受到极大影响。从20世纪90年代开始，蚕桑行业逐年下滑，其中主要的因素是劳动力外出和蚕病危害，尤以微粒子病破坏严重。根据巴斯德的研究，家蚕微粒子病的病原是原生动物中的家蚕微粒子虫，在显微镜下观察其孢子一般为卵圆形，呈淡绿色，有折光性（如图1）。微孢子由孢子壁，极膜层，极丝，孢原质和后极泡组成［1］。此外还发现微粒子是唯一可以通过母蛾胚胎传播给下一代的蚕病。为了避免该病的发生，每年蚕种生产单位都必须对产卵母蛾对号入座进行显微镜检查，将带毒的母蛾所产下的蚕卵按标准规定严格淘汰，保证蚕种健康。显微镜检法多年来一直为各国蚕桑行业用来检疫微粒子病的有效途径，其效果也是有目共睹的。该方法的使用主要依靠镜检人员对每个玻片观察5至10个左右视野来判断母蛾是否带毒而进行淘汰，因此蚕种检测工作对镜检人员的操作技能、专业判断、业务素质及设备情况要求很高，而这些人为因素和客观条件都有可能造成我们在镜检环节中把带毒不合格蚕卵当成健康蚕卵投放到生产上去，从而给蚕业行业带来灾难性破坏。

图1 显微镜检下的微孢子

1 当前母蛾镜检中存在的问题

1.1 镜检视野是否不足

目前镜检单位通常按蚕种分类来制定镜检标准：对于一代杂交种，其镜检视野一般在5至10个左右，如果观察的视野中没发现微粒子孢子，我们可以初步判定该母蛾不带毒，其产下的蚕卵也就表示健康，待按标准抽取对应批次蚕卵催青后对蚁蚕进行检验检疫后方可最终确定该批蚕种是否可以投入生产使用；对于原种、原原种的检验，我们则更为严格，采取对检方法，每各玻片通常观察10个视野。无论是一代杂交种还是原种、原原种的检验，都是需要耗费大量人力，且检验过程也相对繁琐。每年的蚕种检测工作时间比较集中，工作量大，我们的检测人员长时间在显微镜下观看，难免会出现视野不足，从而不能全面判断。同时，有的玻片里面微粒子孢子较少，不易发现，检测人员个人原因就有可能把带毒的蚕种误判为健康蚕卵，从而让其流入生产。这也解释了我们每年进行严格的蚕种检测与淘汰，而微粒子依然存在的原因（当然这其中不乏养蚕过程中遭到微粒子的入侵，但是也不能否认蚕卵自身带微粒子）。

1.2 根据带毒率进行蚕种淘汰

目前蚕种检验标准规定的有毒淘汰率比较严格，若原种检测出有毒母蛾数在全部母蛾数中超过2‰这一比例，则整批原种就必须淘汰；对于一代杂交种，则按有毒母蛾集团数不超过5‰为淘汰标准。这种宁错勿放的原则给制种单位带了极大挑战，本来生产的一批原种中只有几个蛾区检测出带毒，而这一比例刚好超过2‰，都必须把这批蚕种中健康的蚕种全部一起销毁，这不仅是一种资源浪费，而且对制种单位来讲更是耗材耗力。

1.3 对人员要求高

我们的微粒子孢子镜检工作主要是通过专业人员对镜检区域观察，然后判定我们的样品是否带毒，而这一环节与检测人员专业操作技能、专业判断、业务素质有很大关联。因此母蛾显微镜检对人员要求极高，不仅要求检测人员要有丰富的理论知识，而且还需具备多年镜检经验。在当前从事蚕桑行业的各个单位，专业新生力量缺乏，人员结构不合理，急需大量的专业人才加入来充实行业队伍。

2 微粒子检测新方法的发展探索

当前科学技术发达，我们可以充分利用科学技术带来的便利，找到一种高效、快速、检测结果准确无误、检测灵敏度高的新方法来取代母蛾显微镜检法。对于微粒子检测新方法的探索，本文主要从以下三个方向阐述目前在微粒子检测中研发的新方法、新技术。

2.1 试纸显色检验法

该方法目前在很多检测领域都有使用，其特点是快速、高效、易鉴别、且检测结果准确无误，最明显的例子就是pH试纸在检测液体酸碱性方面的使用，根据所取样本在试纸上的显色情况，在酸碱显色图上对比颜色就能简单判断该样本液体的pH值大小。同理我们也可以根据微粒子孢子的结构分析，找到其中一种物质能够用显色反应来来鉴定，然后制作试纸，在检测微粒子孢子时只需要把母蛾研磨，取一滴研磨液置于试纸上，如有显色则判定为该母蛾带毒，对应淘汰所产蚕卵。这种方法在使用上省时省力，操作简单，对人员要求不高，符合当前检种需要，而且检测结果比显微镜检法可靠。目前已有报道的是微粒子试纸检测研究｛2｝，只是该研究中使用的试纸对检测的微粒子显色较浅，不容易观察，但是至少证实了该方法可以在家蚕微粒子诊断上得到应用。

2.2 荧光染色法

刘吉平［3］等探讨了应用荧光染色剂CalcofluorWhiteM2R鉴别微孢子，结果证明在显微镜下微孢子被染上青蓝色荧光，而寄主的组织碎片、病毒、细菌等均不被染色，具有高度特异性。但该方法只局限于实验室使用，因为它对操作设备要求高，对于生产检测尚无法投入。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。

2.3 PCR检测技术

目前有报道的关于使用PCR技术在微粒子检测上的研究有许多，如鲁兴萌［4］等应用PCR在微粒子检测应用中的研究；刘骏［5］等应用PCR试剂盒诊断微粒子等。这些新兴方法的研究确实能够检测出微粒子，但其不足之处在于应用PCR技术检测微孢子的问题主要集中在检测的灵敏度不高、特异性不够及成本高等，由此限制了PCR技术在生产上的应用，不过这也为今后的检测方法指明了一个方向。

3 讨论

传统的显微镜检法虽然是当前各蚕种检验单位主要的检测方法，但是经过多年使用，其存在的问题也越来越多。为了有效解决当前母蛾镜检法中存在的不足，确保在检查过程中做到检测结果准确无误，我们有必要找到一种高效、快速、省时省力的新方法来代替母蛾显微镜检法。新方法的使用必须具备高效快速、检测结果准确无误、操作简单、对人员不高，同时也省时省力，符合目前蚕种生产检验需求。文中提到的三个方向均是在实验室条件下应用研究的，具体落实在生产上还需大量研究，其中试纸显色检测法最有可能成为今后取代母蛾显微镜检法的一种新技术，相比其他两种方法，试纸显色检测具备操作简单、高效快速、成本低廉等优点，相信经过全国蚕桑行业从业人员共同努力，新方法、新技术终究会有来临的一天。

［1］金伟.家蚕病理学［M］.北京：中国农业出版社，2001：148－150.

［2］芦琨.家蚕微粒子病免疫学快速检测试纸条的研制［D］.［硕士学位论文］.重庆：西南大学，2009.

［3］刘吉平，曾玲.CalcofluorWhiteM2R荧光染色法识别家蚕微孢子虫［J］.昆虫学报，2007，50（11）：1185－1186.

［4］鲁兴萌，李光才，孟祥坤等.家蚕微粒子病的PCR检测技术研究与应用［J］.蚕业科学，2011，37（5）；0878－0882.

［5］刘骏，钱科，沈中元.家蚕微粒子病PCR快速检测技术研究及诊断试剂盒的研制［J］.中国动物检疫，2009，26（10）：49.

邹邦兴（1989－），男，本科，研究实习员，主要从事家蚕品种选育及推广。

现代农业产业技术体系（蚕桑）专项；四川省“十三五”农作物育种攻关项目；四川省“十三五”财政创新能力提升工程专项。