黄瓜耐低氮生理与分子机制

范莲雪+郝宁+张天怡+陈焕轩+秦智伟+武涛

摘要：为理解和阐述黄瓜耐低氮的生理与分子机制，以前期试验筛选出的耐低氮性强的黄瓜品种D0328和耐低氮性弱的黄瓜品种D0422为材料，于2014年4—7月对二者在低氮胁迫（3 mmol/L NO-3）和正常氮（14 mmol/L NO-3）下生理和分子指标的变化规律及差异进行研究。结果表明，在低氮胁迫下，耐低氮性不同的2个黄瓜品种D0328和D0422在整个生长发育的关键时期（苗期、抽蔓期、盛果期），氮素吸收相关生理指标，如地上和地下部分硝态氮含量，地上和地下部分总氮含量没有显著差异；氮素同化相关生理指标，如硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）活性也没有显著差异；同时，与氮素吸收和同化相关基因响应模式一致。然而，在低氮胁迫下的盛果期，D0328的可溶性蛋白质含量显著低于D0422，暗示其可能具有较高的氮素再循环效率；同位素示踪结果进一步证明，D0328具有比D0422高的氮素再循环效率。根据上述规律证明，氮素再循环效率是影响黄瓜耐低氮能力的关键因子之一。

关键词：黄瓜；耐低氮；氮素再循环；低氮胁迫；生理变化；分子机制

中图分类号： S642.201文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）05-0117-05

氮素作为一种大量矿物质元素，是核苷酸和蛋白质的主要成分。它不仅是植物细胞中许多重要结构遗传和代谢等复合物的重要组成部分，也是叶绿素和能量转换复合物（如ATP等）的主要组成成分，因此被绝大多数植物在整个生长发育阶段所需要[1-4]。在大多数的农业种植体系中，氮肥的供应通常影响作物产量，包括黄瓜（Cucumis sativus L.）等园艺作物。农民盲目施用过量氮肥也会造成环境恶化、生产成本增加、黄瓜硝酸盐含量超标等现象[5-7]。为解决这一系列问题，深入研究黄瓜耐低氮的机制是必要且漫长的过程。

随着黄瓜耐低氮机制研究的陆续开展，现已取得了一些成果。徐志远将黄瓜的经济产量、株高、真叶面积、根体积、根干质量、叶绿素含量6个指标确定为鉴定黄瓜耐瘠薄指标[8]。于明磊等以叶绿素b含量为黄瓜耐低氮性最佳的评价指标，筛选出耐低氮性最强品种D0328和耐低氮性最弱品种D0422，并进行了相关特性的分子标记[9]。徐静静等从生理角度发现耐低氮能力强和耐低氮能力弱的黄瓜叶片总氮含量、硝酸还原酶活性、叶绿素含量、叶片干质量、叶面积等指标在生育期内响应低氮胁迫的模式均没有显著差异，之后也对根系相关指标的变化进行了分析[10-11]。冯卓对耐低氮能力弱的黄瓜品种在低氮胁迫下幼苗叶片在转录水平及蛋白质水平进行了差异比较[12]。何红梅等对低氮胁迫下黄瓜钙依赖蛋白激酶基因CsCDPK进行了克隆、表达分析及遗传转化[13]。冯卓等对谷氨酰胺合酶基因[WTBX][STBX]GS1[WTBZ][STBZ]和黄瓜硝酸盐转运蛋白基因[WTBX][STBX]CsNRT1.5[WTBZ][STBZ]等进行了克隆与表达分析[14-15]。然而，从不同发育时期结合氮素吸收、同化和再循环相关生理及分子指标了解影响黄瓜耐低氮能力重要因子的报道尚未出现。

植物的氮素代谢过程主要包括氮素吸收、同化、再循环3个阶段。植物吸收系统对硝酸盐吸收具有不同的亲和性：高亲和系统和低亲和系统。每个高亲和性与低亲和性的硝酸盐转运系统都由组成型和硝酸盐诱导型组成[16]。根部吸收获得的硝酸盐一小部分直接在根部被同化吸收，很大一部分被运输到茎部，首先在硝酸还原酶（NR）的作用下在细胞质中被还原成亚硝酸盐，然后在质体中被亚硝酸还原酶还原成铵盐，再在谷氨酰胺合成酶（GS）的作用下催化氨的同化，使其转变成谷氨酰胺（Gln）和谷氨酸（Glu）[17]。在植物的营养生长阶段，叶片是氮的存储器，在后期衰老过程中，这些氮多数以氨基酸的形式被再循环利用，而叶绿体是一个重要的氮再动员库，因为它包含了大约80%的叶片总氮并以蛋白质的形式存在其中[18-19]。植物中氮素含量、硝态氮含量以及可溶性蛋白质含量直接反映作物体内氮素积累与代谢情况，是研究作物氮素营养、氮素同化利用与再利用状况的重要指标[20]。NR和GS活性决定氮素的代谢速度，也能反映植物体内氮素状况[21]。另一方面，低氮在遗传学角度的相关研究也已经被报道，如水稻等耐低氮能力的QTL定位分析等[22]。尽管这些指标在许多作物中已被研究报道，并且存在较大差异，但在黄瓜上进行全面研究的报道比较少，因此为深入研究黄瓜耐低氮机制提供了理论支持。

本研究以耐低氮性强的D0328和耐低氮性弱的D0422这2个黄瓜品种为材料，对二者在低氮胁迫下3个关键发育时期（苗期、抽蔓期、盛果期）的氮素吸收、代谢、再循环相关生理和分子生物学指标进行比较分析，以此确定影响黄瓜耐低氮能力的关键因子，为下一步深入探究黄瓜耐低氮机制提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

笔者所在实验室前期筛选出的耐低氮性最强的黄瓜品种D0328和耐低氮性最弱的黄瓜品种D0422种子，由东北农业大学园艺学院黄瓜课题组提供[9]。

1.2方法

1.2.1播种

将D0328和D0422种子催芽后，直播于 8 cm×8 cm的全蛭石营养钵中，待其子叶展平，将幼苗移栽到规格一致、盛等体积蛭石的塑料桶中，于2014年4月开始，在东北农业大学园艺学院试验站开展以下试验。

1.2.2低氮处理试验

待上述2个黄瓜品种子叶展平时，用低氮（3 mmol/L NO-3）和正常氮（14 mmol/L NO-3）的营养液进行处理，基础营养液配方[23]为1.512 mmol/L NaH2PO4·2H2O，0.257 mmol/L Na2HPO4·12H2O，1.500 mmol/L MgSO4·7H2O，4.000 mmol/L Ca（NO3）2·4H2O，6.000 mmol/L KNO3，8.600 μmol/L C10H12FeN2NaO8·3H2O，10.300 μmol/L MnSO4，1.000 μmol/L CuSO4·5H2O，30.000 μmol/L H3BO3，24.000 nmol/L Na6Mo7O24· 4H2O，130.000 nmol/L CoCl2·6H2O。分別在苗期（37 d）、抽蔓期（50 d）、盛果期（63 d）取材（根和第3～5节位叶片），一部分保存于-20 ℃用于生理指标测定，另一部分用液氮速冻后保存于-80 ℃，用于总RNA的提取。

1.2.315N同位素示踪试验

2个同位素示踪试验分别用于检测营养生长阶段（苗期至抽蔓期）和生殖生长阶段（抽蔓期至盛果期）的氮素再循环效率。用含有15N的14 mmol/L NO3-营养液进行处理，Ca（15NO3）2·4H2O（丰度为10%）和K15NO3（丰度为10%）代替Ca（14NO3）2·4H2O和K14NO3，基础营养液配方如“1.2.2”节所述。

营养生长阶段的同位素试验：子叶展平时，进行15N处理，35 d（T1）时取根和全部标记叶片为初始叶片，剩余植株洗根后用14N营养液处理，42 d（T2）时取标记叶片为初始叶片、新叶、根和花器官。

生殖生长阶段的同位素试验：子叶展平时，进行15N处理，42 d（T3）时取根和全部标记叶片为初始叶片，剩余植株洗根后用14N营养液处理，64 d（T4）时取标记叶片为初始叶片、新叶、根和花器官；每个处理3次重复。

15N的含量计算方法参照Diaz等所述[24]。

1.3生理指标测定

硝态氮含量采用水杨酸比色法[25]测定；总氮含量釆用凯氏定氮法[25]测定；NR活性测定、GS活性测定、可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[25-26]。

1.4总RNA提取、cDNA第一链合成及qRT-PCR

采用Trizol法提取黄瓜叶片总RNA，并用SAM 1000超微量紫外分光光度计检测RNA质量。

按照TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit反转录试剂盒说明书，以总RNA为模板进行逆转录反应，合成 cDNA 的第一链。

依照TOYOBO公司的SYBRGreen Realtime PCR Master Mix说明书，以上述cDNA为模板进行qRT-PCR分析，基因引物序列见表1，参照基因为[WTBX][STBX]1.5数据处理

采用DPS 9.50数据处理系统软件进行生物学统计分析。

2结果与分析

2.12个黄瓜品种在低氮胁迫下氮素吸收能力的比较

植物在低氮胁迫下，可吸收的氮素减少，其体内的硝态氮含量及总氮含量会相应降低。图1表明，在整个发育时期，D0328和D0422在低氮胁迫下，地上、地下部分硝态氮含量以及地上、地下部分总氮含量都低于正常氮处理，且2个品种在低氮胁迫下的变化幅度一致，说明2个黄瓜品种具有相似的氮素吸收能力，也暗示氮素吸收能力并不是引起2个品种耐低氮能力差异的主要原因。

2.22个黄瓜品种在低氮胁迫下氮素同化能力的比较

NR和GS都参与氮同化过程，在植物氮素代谢过程中起着重要作用，并且对外界氮素浓度的反应比较敏感。从图2可以看出，2个耐低氮能力不同的黄瓜品种在低氮胁迫下，地上、地下部分NR活性基本呈现显著降低的趋势。在37、50、63 d时NR活性和GS活性在2个品种间的变化并没有明显的规律，这一点说明氮素代谢能力并不是黄瓜具有较强耐低氮性的主要原因。

利用qRT-PCR对黄瓜生殖生长阶段叶片中氮素吸收和代谢相关基因的表达模式进行分析发现，2个黄瓜品种在低氮脅迫下

2.42个黄瓜品种在低氮胁迫下氮素再循环效率比较

可溶性蛋白质是氮素再循环的一个重要来源和指标。图4结果显示， D0328叶片中可溶性蛋白质含量在苗期、抽蔓期

和盛果期均显著低于正常氮条件下，而D0422地上部分可溶性蛋白质含量在苗期和抽蔓期并没有显著改变，却在盛果期明显减少（图4-a）；而且在盛果期D0328低氮胁迫下叶片中的可溶性蛋白质含量减少75%，D0422减少57%（图4-a）；而2个品种根部的可溶性蛋白质含量在3个时期并没有明显减少（图4-b）。蛋白质降解是氮素再循环的必要过程之一，这些结果表明在生殖生长阶段即盛果期，D0328比D0422具有更高的氮素再循环效率。

2.52个黄瓜品种生殖生长时期的氮素再循环能力比较

15N同位素示踪试验进一步证明，在营养生长阶段（T1—T2），2个品种初始叶片中15N的分配比例相似，说明具有相似的[CM（25]氮素再循环效率（图3结论与讨论

植物在遭受低氮胁迫时，体内会发生一系列的生理生化适应性反应[27]。许多研究表明，在低氮条件下，作为氮素同化的关键酶NR和GS活性降低，蛋白质含量也随之下降[28-29]。然而，对于不同作物及不同部位对低氮的响应也存在差异，例如，Kant等在研究盐芥比拟南芥耐低氮胁迫的机制时发现，与充足的氮处理相比，低氮胁迫下盐芥根和茎中的NR活性变化不大，拟南芥的NR活性在根和茎中分别下降3.4倍和3.7倍；盐芥和拟南芥的GS活性不受低氮胁迫影响，变化不大；拟南芥的可溶性蛋白质含量都下降，但是盐芥的下降比例少[30]。以上研究结果与本试验结果产生的差别可能是由于作物种类及研究部位的不同引起的。

同位素示踪技术在研究植物氮素吸收、转运和积累中被广泛应用[35-37]。本试验通过对2个耐低氮能力不同的黄瓜品种中营养生长阶段和生殖生长阶段的氮素再循环效率进行比较发现，D0328在生殖生长阶段的氮素再循环效率高于D0422，在营养生长阶段并无区别。

本研究从黄瓜生长发育的3个关键时期，对2个耐低氮性不同黄瓜品种的氮素吸收、代谢和再循环效率进行分析。结果显示，耐低氮性强的D0328的氮素再循环效率高于耐低氮性弱的D0422，而氮素吸收和代谢能力相似；同时，2个品种的氮素吸收、代谢相关基因的表达模式基本一致，初步推断黄瓜氮素再循环效率可能是影响其耐低氮性的主要因素。接下来的同位素示踪试验发现，在生殖生长阶段2个黄瓜老叶片中的15N分配出现了不同，说明耐低氮性强的D0328在生殖生长阶段的氮素再循环效率高于耐低氮性弱的D0422。从于明磊等对黄瓜耐低氮性进行的种质资源筛选中，发现从形态学角度耐低氮性强的黄瓜品种衰老延迟[9]。冯卓等对黄瓜幼苗低氮胁迫下进行转录组分析时，鉴定出一批响应低氮胁迫的基因，其中部分低氮响应基因与氮素再循环相关[14]。上述数据初步阐明，生殖生长阶段的氮素再循环效率是影响黄瓜耐低氮性的主要因子之一。这一结论为接下来深入开展黄瓜耐低氮生理与分子机制的研究提供了重要的理论基础。

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