多重RT—PCR检测蝴蝶兰3种病毒CymMV、ORSV和CMV

涂小云++董小艳 +郭春梅 何俊平 +鲍恩亚

摘要：根据建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）、齿兰轮斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）和黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）3种病毒外壳蛋白基因序列保守序列设计特异性引物，以病毒侵染的蝴蝶兰总RNA反转录的cDNA为模板进行扩增，建立了三重RT-PCR同时检测该3种病毒的方法。CymMV、ORSV和CMV 3种病毒特异扩增的片段分别为561、433、306 bp。用该方法对17个疑似病毒感染的蝴蝶兰样品进行檢测，结果13个材料检测出CymMV特异带，2个材料检测出ORSV病毒特异带，1个材料检测出CMV病毒特异带，1个材料同时检测出CymMV和ORSV病毒2条特异带，所检测的17个蝴蝶兰材料未发现3种病毒复合侵染的情况。

关键词：蝴蝶兰；多重RT-PCR；建兰花叶病毒；齿兰轮斑病毒；黄瓜花叶病毒；检测方法

中图分类号： S436.8+1文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）05-0091-02

兰花是一种高价值的观赏花卉，但一旦感染病毒，其观赏价值和经济价值将受到严重影响。近年来，随着兰花国内外贸易和种质交流频率的增加，兰花病毒病的发生有蔓延趋势。目前，至少有28种病毒可感染兰科植物，其中我国兰科植物感染的病毒以建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）、齿兰轮斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）为主，且这2种病毒复合感染占多数，也有少数蝴蝶兰感染黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）[1]。CymMV和ORSV主要借助机械性伤口进行传播，CMV 可借汁液传染，也可通过蚜虫传播。这3种病毒病感染兰花后可迅速扩散，且无有效防治药剂；因此，有必要建立多种病毒的高效检测方法，尽早检出感病植株并实施销毁，避免兰园大面积受损。

目前检测植物体内病毒的主要方法有电镜法、血清学鉴定和PCR技术等。其中PCR技术，尤其是多重PCR，具有快速、便捷、灵敏度高和特异性强等显著优点，现已广泛用于病原微生物的检测。多重PCR是在同一反应体系中，利用一对或多对引物同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，比普通单重PCR更为高效、经济和简便。郑轩等在一个PCR体系中成功对5种病毒复合侵染的烟草材料进行多重扩增，建立了能同时检测烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草蚀纹病毒、马铃薯Y病毒和烟草脉带花叶病毒的多重PCR检测体系[2]。张威等[3]和罗文彬等[4]分别建立了可同时检测马铃薯3种病毒和5种病毒的多重PCR方法。

多重PCR在兰花病毒检测的利用主要集中于CymMV和ORSV的双重检测[5-9]，如郑国华等利用2对特异引物在同一个PCR反应体系进行扩增的方法，建立了二温式多重 RT-PCR同时检测CymMV和ORSV 2种病毒的方法[8]；章鹏程等利用1对简并引物，通过一步式IC-RT-PCR可以同时检测CymMV和ORSV复合感染情况[10]。凤仙花坏死斑病毒（impatiens necrotic spot virus，INSV）和CymMV 2种病毒也可以通过双重RT-PCR同时检测[11]。樊荣辉等通过优化三重PCR反应条件，一次扩增能同时检测文心兰CymMV、ORSV和菜豆黄花叶病毒（bean yellow mosaic virus，BYMV）的特异片段[12]。CymMV、ORSV和兰花斑点病毒（orchid fleck virus，OFV）的三重PCR检测体系最近也已有报道[13]。但CymMV、ORSV和CMV的三重PCR检测体系目前还未见报道。本研究根据CymMV、ORSV和CMV外壳蛋白基因序列保守区域设计特异性引物，建立了三重RT-PCR检测该3种病毒的方法，可准确快速、简便、经济地检测出蝴蝶兰带毒情况，为尽早发现、消除病害，减少经济损失提供了技术支持。

1材料与方法

1.1材料

CymMV、ORSV和CMV 3种病毒2013年采自江苏省连云港振兴实业集团有限公司的兰花基地。其他供试蝴蝶兰材料来源于连云港当地花卉市场。

1.2引物设计

1.3cDNA获取

取蝴蝶兰新鲜叶片，液氮研磨成粉状，用Trizol RNA试剂盒提取叶片总RNA，然后用Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）将RNA反转录为cDNA第一链，随即保存于-20 ℃备用。所有操作均按试剂盒说明书进行。

1.4单重RT-PCR确定产物的特异性

采用Vazyme Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，20 μL反应体系的组成如下：2× Vazyme mix buffer 10.0 μL，10 μmol/L上游引物和下游引物各 1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，无菌水 7 μL。PCR反应程序如下：95 ℃预变性3 min；93 ℃变性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5多重RT-PCR检测的建立

在单重PCR基础上，将上述3种cDNA模板等量混合，保持其他条件不变，分别对模板浓度、退火温度、引物浓度和循环参数进行优化，最后确定多重PCR最优反应体系。采用Vazyme Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，20 μL反应体系的组成如下：2× Vazyme mix Buffer 10.0 μL，10 μmol/L CymMV上游引物和下游引物各 0.8 μL，10 μmol/L ORSV上游引物和下游引物各 0.8 μL，10 μmol/L CMV上游引物和下游引物各 0.5 μL，稀释10倍的cDNA模板1.0 μL，无菌水4.8 μL。PCR反应程序如下：95 ℃预变性3 min；93 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

2结果与分析

2.1单重RT-PCR检测体系

分别单独采用1对引物对获得的蝴蝶兰cDNA样品进行PCR扩增，3对引物均能在相对于的样品中获得预期大小的扩增产物（扩增产物分别为561、433、306 bp），电泳呈单一明亮条带（图1），阴性水对照没有阳性条带，表明检侧结果是特异性的，适合用于病毒检侧。

2.2三重RT-PCR检测体系

扩增CymMV、ORSV和CMV的3对引物按等量浓度混合，对蝴蝶蘭cDNA混合样品进行扩增，效果不理想。经过系列优化后，扩增CymMV、ORSV和CMV的3对引物的浓度比例为CymMV ∶[KG-*3]ORSV ∶[KG-*3]CMV= 1.6 ∶[KG-*3]1.6 ∶[KG-*3]1，蝴蝶兰cDNA混合样品稀释10倍，可以在同一个PCR反应体系中成功扩增出3个利用优化后RT-PCR体系，检测疑似病毒侵染的17个蝴蝶兰材料，结果如图3所示：13个（1～3、5～7、10～13、15～17）材料检测出CymMV特异带，2个（4、9号）材料检测出ORSV病毒特异带，1个（8号）材料检测出CMV病毒特异带，1个（14号）材料检测出CymMV和ORSV病毒2条特异带，阴性水对照（18号）无CymMV、ORSV或CMV特异带。所检测的17个蝴蝶兰材料未发现3种病毒复合侵染的情况。

3讨论

普通单重RT-PCR可以对单一病毒进行有效检测，但CymMV、ORSV等病毒广泛分布于世界各地商业生产的兰花中，感染30多种兰属花卉，且这些病毒还易于形成复合侵染，严重降低兰花的商业价值[14]。同时检测2种或多种主要兰花病毒的双重或多重PCR技术已有多个成功的报道，它们可以降低检测成本，缩短病毒检测时间，提高检测效率，包括针对CymMV和ORSV的双重PCR检测[5-10]，针对INSV和CymMV双重PCR检测[11]，针对CymMV、ORSV和BYMV的三重检测[12]，针对CymMV、ORSV和OFV的三重PCR检测体系[13]等。对于病毒的检测，并非所有的病毒都可以用同一种方法检测，也没有一种方法可以检测出所有的病毒，应根据所研究的病毒特性及具体的试验条件、科研水平和操作人员的技[CM（25]术水平选用合适的方法。本研究针对蝴蝶兰CymMV、

ORSV和CMV 3种病毒，成功建立了RT-PCR三重检测技术，该项技术的关健是要选用合适的引物，在保证引物特异性的前提下，避免引物之间的互作干扰。本研究中所涉及3种病毒外壳蛋白基因序列同源性较高，因而用PCR方法对其进行检测可获得较稳定可靠的结果。

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