转基因成分的检测方法综述

阮先乐+张杰

摘要：随着转基因生物在全世界的广泛应用，转基因成分检测技术越来越受到广大消费者、各国政府及相关机构人员的重视。本文从聚合酶链式反应（PCR）检测技术、环介导等温扩增检测技术、近红外光谱检测技术、生物传感器检测技术、生物芯片检测技术和蛋白质检测技术等方面进行综述，并提出今后转基因成分检测技术的发展趋势和研究方向。

关键词：转基因；成分；检测方法

中图分类号： Q785文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）05-0012-03

达及转基因生物对环境、食用安全性的影响，从而建立一套高效的技术研究体系；另一方面，转基因生物安全管理部门也有必要建立一套转基因成分检测技术标准，使各项工作得以顺利实施。2002年欧盟要求对转基因产品从生产、运输、保存、销售等过程进行全程的跟踪和检测[1]。现在已有65个国家和地区对转基因产品采取强制性的标志管理制度，但也有一些国家和地区采取自愿标志模式[2]。2014年5月27日，我国农业部发布《农业部关于进一步加强农业转基因生物安全监管工作的通知》，要求各级农业部门，要以水稻、玉米、大豆和油菜种子为重点，依法严厉查处非法生产、加工、销售转基因种子的行为。2015年10月1日起施行的《中华人民共和国食品安全法》第六十九条明确要求生产经营转基因食品应当按照规定显著标志。

1转基因成分检测技术

1.1PCR检测技术

PCR检测技术是一种灵敏度高、技术较成熟的转基因成分检测方法。根据特异性的不同可把它分为筛查法、目的基因特异性、构造特异性和事件特异性4种方法[3]。检测的主要基因包括调控基因、标记基因和目的基因，其中调控基因包括启动子和终止子。常用的启动子是花椰菜花叶病毒CaMV 35S，终止子是脂肪碱合成酶NOS，标记基因有Barr（抗草丁膦基因）、Kmr（抗卡那霉素基因）、Neor（抗新霉素基因）、Hygr（抗潮霉素基因）[4]。目前，PCR检测技术已经成功地应用在玉米、大豆、水稻和小麦的转基因成分检測上[5-8]。

转入多个目标基因，需要用多重PCR技术进行检测，这种技术不但能提高检测效率，而且能够有效地防止假阳性。魏霜等研究表明，以水稻内源基因SPS、外源抗虫基因CrylAb、外源抗虫基因CrylAb/Ac、外源抗虫基因Btc、报告基因GUS、NOS终止子和CaMV 35S启动子为检测对象，建立的7重PCR体系能有效地检测出水稻中的转基因成分，检测过程比较简便，特异性比较好[9]。利用此项技术，在烟叶、甘蔗、大豆、玉米、柑橘和棉花上都成功地检测到转基因成分[10-15]。

目前，许多国家和地区对转基因产品规定了最低阈值，如欧盟和俄罗斯为0.9%，日本和中国台湾为5.0%，韩国为30%[16]。为此，须要采用实时荧光定量PCR技术保证转基因成分的定量检测。沈元劼等用实时荧光定量PCR研究棉花黄萎病菌，检测灵敏度为100 copies/μL[17]。仇有文等采用实时荧光定量PCR技术检测耐除草剂转基因大豆 A5547-12，结果表明定量PCR检测方法的LOD和LOQ分别是1、10 copies/μL[18]。王盛等采用实时荧光定量PCR技术检测转基因烟草中外源绿色荧光蛋白基因（GFP）的拷贝数，在检测的5株转基因烟草中，GFP基因的拷贝数分别为5、8、19、28、45个，非转基因烟草植株的GFP基因拷贝数为0[19]。

1.2环介导等温扩增检测技术

2000年Notomi等发明了一种新的DNA扩增方法，即DNA环介导等温扩增技术（loop mediated isothermal amplification，简称LAMP）[20]。这种技术对目的基因6个不同区域分别设计了4种不同的特异性引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件下反应，从而完成核酸的扩增。邵碧英等研究表明，建立的LAMP检测方法能稳定、特异地检测转基因大豆 A2704-12品系，检测限达到了0.1%[21]。闫兴华等对玉米LY038中cordapA基因建立的LAMP扩增技术灵敏度高、特异性好、稳定性较高[22]。陈金松等用LAMP法针对玉米表达载体的花椰菜花叶病毒CaMV 35S进行检测，结果表明，这种方法特异性高、用时少、成本较低，为检测转基因玉米提供了一种更加简便快速的方法[23]。王永等建立的转基因水稻中crylAc基因的LAMP检测法比传统的PCR检测方法最低定性检测限高10倍，它非常适合抗虫转基因水稻的快速检测[24]。

1.3近红外光谱分析检测技术

近红外光谱是介于可见光谱和中红外光谱之间的电磁波，波长范围在780～2 526 nm之间，它不会对人体有任何伤害，也不会对周围的环境造成污染，同时这项技术对大多数样品不需要进行预处理就可以直接测量，真正地做到低成本、快速、实时和无损测量[25]。2002年，Farid首次提出利用近红外光谱可以解决聚合酶链式反应法和酶联免疫法在转基因农产品检测中所存在的问题[26]。

闫灵采集了金龙鱼等6个品牌的菜籽油，利用近红外光谱仪对117份样品进行了全谱段的光谱采集，结果表明，基于近红外光谱的转基因菜籽油快速鉴别方法是可行的[27]。翟亚锋等对不同品种的9个转基因小麦样品种子分别建立了鉴别模型，通过近红外光谱仪扫描获得光谱数据，结果表明该方法具有较高的鉴别准确度，可以作为一种快速无损的转基因小麦种子鉴别方法[28]。吴江等利用近红外光谱分析仪对大豆扫描得到反射光谱，应用主成分分析结合反向传播（backpropagation，简称BP）神经网络法分析鉴别，结果说明近红外光谱结合主成分分析和BP神经网络法能无损快速准确地鉴别转基因大豆[29]。芮玉奎等以转基因棉花及对照作为试验材料，利用近红外光谱仪对转基因棉花及对照根际土壤和非根际土壤中的全氮和有机质进行分析研究，同时利用标准的方法进行对比检测，结果表明近红外检测样品的结果与标准方法结果无明显的差别[30]。唐丽娟等运用傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）技术分析过量表达HPS/PHI转基因与野生型天竺葵在甲醛胁迫下体内各物质含量的变化规律及光谱表征，结果表明FTIR可作为一种鉴定有甲醛光合同化途径的转基因天竺葵与野生型天竺葵表型差异的新技术[31]。

1.4生物传感器检测技术

生物传感器是利用细胞、组织、酶或免疫制剂等生物识别元件的特异性生物化学反应，借助光、电等各种信号对化学物质进行检测的一类装置[32]。该技术具有高灵敏度、高特异性、实时和快速等优点，在环境检测、食品和发酵等方面得到了广泛的应用[33-35]。近年来，随着转基因产品逐渐走入人们的生活及生物产业的迅猛发展，生物传感器在转基因产品检测方面也发挥了越来越重要的作用。王学亮等利用DNA电化学生物传感器对外源草甘膦乙酰转移酶基因片段进行检测，检出限是0.032 nmol/L[36]。许凯等利用DNA电化学生物传感器定量检测根癌农杆菌终止子基因片段，检出限是0081 nmol/L[37]。茹柿平以转基因作物中常见的CrylAb蛋白为检测对象，利用电化学免疫生物传感器技术实现了对CrylAb蛋白的定量检测[38]。王健通过研究表明，DNA生物传感器对NPT-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因中特异片段的准确检测可作为一种通用方法应用于许多转基因植物的快速鉴定[39]。肖守斌建立的表面等离子共振生物传感检测系统能够灵敏、快速、简单地用于转基因玉米的检测[40]。

目前生物传感器的应用受到稳定性、重现性和使用寿命的限制，再加上转基因生物成分的复杂性，使得实现商业化的生物传感器数量受到制约。但随着计算机技术、微制造技术和生物材料的不断发展，生物传感器技术在转基因成分检测领域的应用会越来越广泛。

1.5生物芯片检测技术

所谓生物芯片是指采用微加工技术在玻璃、尼龙膜等固体材料上构建微型生物化学分析系统，从而对细胞、核酸片段、蛋白质、糖类及脂类等进行准确、快速和高通量的检验。按照生物芯片上固化材料的不同，可分为蛋白质芯片、基因芯片、组织芯片和细胞芯片等。汪琳等建立的对Cry1Ac蛋白、植酸酶蛋白、Cry1Ah蛋白等3种转基因成分的蛋白芯片检测技术，具有较高的灵敏性、特异性和可靠性[41]。武海斌等采用基因芯片技术结合多重PCR，能够在l张芯片上同时有效地检测及鉴定7种转基因玉米，大大提高了检测的准确率和效率[42]。刘烜等利用基因芯片技术对转基因玉米中相关转基因成分的研究表明，此项技术的检测灵敏度可达到01%[43]。周萍萍等建立的转基因大豆基因芯片检测技术，对CaMV 35S启动子、NOS终止子和外源基因[WTBX][STBX]CP4EPSPS[WTBZ][STBZ]的检测灵敏度均达到0.45%[44]。

生物芯片技术在转基因成分检测中所发挥的作用越来越受到人们的重视，但还需要依赖生物基因数据库的不断建立和完善，依赖于该技术可靠性和特异性的不断提高，才能够在以后的转基因成分检测中发挥更大的作用。

1.6蛋白质检测技术

1.6.1酶联免疫吸附测定（ELISA）法

利用抗原抗体反应，对样品中的蛋白质进行定性或定量检测。王新桐等采用双抗体夹心酶联免疫吸附法定量检测转基因棉花中新霉素磷酸转移酶（NPT Ⅱ）基因，结果表明该方法具有良好的应用价值和应用前景[45]。刘志浩等采用双抗体夹心酶联免疫吸附法定量检测转基因玉米中膦丝菌素乙酰转移酶（PAT）基因，结果表明该方法对转基因玉米中的PAT蛋白能够进行准确、特异和有效的检测[46]。

1.6.2蛋白质印迹（Western Blot）杂交法

利用Western Blot分子杂交技术特异性检测目的蛋白质，它可以确定一个样品中是否含有低于或高于一定水平的目标蛋白质，特别适合不溶性蛋白质的检测和分析。杨烁等采用Western Blot分子杂交技术对转基因水稻中的HPT蛋白质进行分析，结果表明只需要单粒种子的1/10就可以确定是否含有HPT蛋白质成分[47]。兰金苹等采用Western Blot分子杂交技术对NPTⅡ蛋白质在转基因水稻中的表达特征进行了研究，结果表明苗期叶片中这种蛋白质的含量约为其鲜质量的0.08‰[48]，该蛋白质在水稻不同的发育时期、不同的器官和组织中表达量有所不同。

2讨论

PCR和LAMP这2種检测技术在实际运用中，存在引物设计的特异性、核酸的提取质量、产品在加工过程中产生的抑制剂等问题，在一定程度上限制了这2种检测技术的应用。蛋白质检测技术的问题是由于蛋白质在深加工过程中容易失去抗原性，此项技术也不适合深加工转基因产品的检测。近红外光谱技术、生物传感器技术和生物芯片要求技术含量高，操作比较复杂，数据分析也比较麻烦。综上所述，在进行转基因成分检测时，无论采用哪一种方法，都需要针对转基因产品进行大量的试验，弄清楚如何提取DNA、如何建立反应体系、如何进行分析和描述等工作。综合运用基因水平、蛋白质水平的检测技术，综合运用定性和定量检测技术。从而为转基因产品的研究和安全评估提供可靠的技术保障体系。

随着转基因技术的发展，将来会有越来越多的转基因产品走进人们的生活，对转基因成分的检测技术也提出了更高的要求，向着快捷、简便、灵敏、高效的方向发展，同时向着一次性、可视性的转基因成分检测方向发展。

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