蝙蝠蛾拟青霉质量标准及免疫活性研究

周毓麟，李兰洲，胡文继，滕伟卓，郑德庆，刘 洋,*

(1 吉林大学 生命科学学院，长春 130012；2 吉林省长春市沐石河镇中心校，长春 130508)

蝙蝠蛾拟青霉质量标准及免疫活性研究

周毓麟1，李兰洲1，胡文继1，滕伟卓1，郑德庆2，刘 洋1,*

(1 吉林大学 生命科学学院，长春 130012；2 吉林省长春市沐石河镇中心校，长春 130508)

目的：建立蝙蝠蛾拟青霉菌100 L发酵菌丝体质量标准，并验证其安全性和免疫调节活性.方法：采用高效液相色谱等方法，在测定菌丝体产量和腺苷含量的基础上，测定其水分、一般杂质、酸不溶性杂质和重金属含量.此外，进行了小鼠免疫增强实验.结果：菌丝体产量不少于20.80 g/L，菌丝体中腺苷含量不少于0.27%，水分含量不超过6.71%，总灰分含量不超过1.26%，酸不溶性灰分含量不超过0.15%，重金属含量少于国家标准计入质量标准正文.小鼠免疫增强实验显示，发酵菌丝体显著提高小鼠迟发型超敏反应，并对 IL-10、IL-12、IL-12R、IFN-α 等炎症相关因子水平具有上调作用.结论：初步建立了蝙蝠蛾拟青霉菌100 L发酵菌丝体质量标准，并证实其在小白鼠体内的安全性和免疫调节活性.

蝙蝠蛾拟青霉；发酵；质量标准；免疫调节

冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)是虫草菌寄生于蝙蝠蛾类昆虫的幼虫后形成的虫菌结合体，包括了蝙蝠蛾幼虫的虫体残骸和真菌的子座[1].冬虫夏草良好且广泛的生物学活性，吸引越来越多的研究者投入其研究开发中[2].但冬虫夏草严格的寄生性与特殊的生存环境依赖性制约其产业化发展[3]，同时掠夺性挖掘和环境的破坏使冬虫夏草野生资源濒临枯竭.野生冬虫夏草的生长环境开放等原因还导致虫草质量差异巨大、重金属含量超标等问题[4,5].为此，国内外学者在寻找质量可控的冬虫夏草代用品方面做了大量工作.

蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)是从天然冬虫夏草中分离得到的具有相似化学成分的真菌，其多糖、虫草酸、虫草腺苷(冬虫夏草中的主要有效成分)和虫草素均具有显著的药理活性[1,6,7]，有望成为野生虫草的替代产品[8,9].

目前关于蝙蝠蛾拟青霉质量标准研究主要集中于菌丝体产量和其有效成分如腺苷、甘露醇和多糖等的含量上[10,11].并且，产业化必须的大规模发酵方面的研究报道还很少.本文在菌丝体产量和腺苷含量的基础上，通过对水分、灰分、酸不溶性灰分和重金属等含量的测定，建立了蝙蝠蛾拟青霉100 L发酵菌丝体质量标准，并利用小鼠免疫增强实验对菌丝体动物安全性和免疫调节活性进行评估，为进一步的放大发酵规模奠定实验基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

蝙蝠蛾拟青霉SY02菌株(本实验室选育).

1.1.2 实验动物

昆明种小鼠，体重20～22 g，(购自长春生物制品研究所)许可证号：SCXK-(吉)2014-0005.

1.1.3 试剂

腺苷标准品、甲醇(色谱纯，Sigma 公司)，金水宝胶囊(江西济民可信公司)，IL-10、IL-10R、IL-12、IL-12R、IFN-α、NF-κB 等ELISA试剂盒及绵羊红细胞(SRBC)(上海源叶生物科技有限公司)，其他试剂均为国产分析纯.

1.1.4 仪器

台式恒温摇床(INNOVA 4000，美国)，高速冷冻离心机(GentrifuGe5810R，德国 Eppendorf)，真空冷冻冻干机(HLPHA-1-4，德国 Christ)，高效液相色谱仪(SPD-10A，日本岛津)，紫外分析仪(UV-1V，北京新技术公司).

1.2 蝙蝠蛾拟青霉菌丝体质量标准建立

1.2.1 菌粉制备

培养基组成(1 L)：30 g蔗糖，10 g蛋白胨，18 g酵母浸粉，3 g KH2PO4·3H2O，3 g MgSO4·7H2O，0.235 g VB1，0.011 g ZnCl2，10 g (NH4)2SO4.

菌种活化：100 mL摇瓶装液40 mL培养基，接种斜面保存的蝙蝠蛾拟青霉SY02菌株，培养温度26 ℃，转速150 r/min，培养时间3 d，既得蝙蝠蛾拟青霉种子培养基.

菌粉制备：100 L发酵罐装液70 L培养基，接入5%种子培养液进行培养，26 ℃(150 r/min)培养5 d，得到的发酵培养液4000 r/min离心10 min，沉淀冻干，即得蝙蝠蛾拟青霉菌丝体冻干粉末，备用.

1.2.2 蝙蝠蛾拟青霉性状鉴别实验

通过直接观察菌粉的形态、颜色、气味、质地来鉴别.

1.2.3 蝙蝠蛾拟青霉菌丝体产量

取5批发酵菌丝体冻干粉末，称量计算每升发酵液菌粉质量，即为菌丝体产量.

1.2.4 腺苷含量的测定

采用高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ D)测定腺苷含量.

取5批样品，依法制备供试品溶液，每批2份，每份平行进样2针，精密吸取供试品溶液 20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算5批样品中腺苷含量.

1.2.5 一般杂质含量测定

水分含量测定：取5批样品，按照水分测定法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ H 第二法)测定，计算供试品中含水量(%).

总灰分含量测定：取5批样品，按照总灰分测定法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ K)测定，计算供试品中总灰分的含量(%).

酸不溶性灰分测定：取5批样品，按照酸不溶性灰分测定法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ K)测定，计算供试品中酸不溶性灰分的含量(%).

1.2.6 重金属检查

取5批样品，测定其铅、汞、铬、镉、砷重金属含量，均采用食品安全国家标准GB5009现行执行标准检查.

1.3 蝙蝠蛾拟青霉免疫调节活性研究

1.3.1 小鼠分组及给药

将120只雌雄各半的健康小鼠，根据体重平均分为5组.即空白对照组、0.6 g/kg金水宝胶囊粉组、3.0 g/kg蝙蝠蛾拟青霉组、1.5 g/kg蝙蝠蛾拟青霉组和0.3 g/kg蝙蝠蛾拟青霉组，空白对照组予同等体积蒸馏水，连续灌胃15 d.

1.3.2 小鼠脏器指数测定

取灌胃15 d的各组小鼠，于末次给药2 h后，称重，脱颈处死.取脾脏，剔除结缔组织，用滤纸吸干脾脏表面液体，称重、记录，由下式计算脾脏指数(%).

脾脏指数=(脾脏重量g/小鼠体重g)×100.

1.3.3 迟发型变态反应实验

取各组灌胃15 d的小鼠，每组各12只，雌雄各半.制备2% SRBC悬液(V /V)，于每只受试小鼠腹腔注射0.2 mL，致敏后4 d，用游标卡尺测量左后足跖的厚度.制备20% SRBC悬液(V /V)，在每只鼠测量部位处皮下注射20 μL.注射24 h后再次测量该足跖厚度, 连续测定3次，计算平均值.

1.3.4 免疫相关细胞因子测定

取灌胃15 d的各组小鼠，在最后一次灌胃2 h后眼球取血，室温放置0.5 h，3000 r/min离心5 min，取上清液，上清液再次3000 r/min离心5 min,取2次离心上清液备用.按照检测试剂盒说明书要求检测IL-10、IL-10R、IL-12、IL-12R、IFN-α、NF-κB等含量.

2 结果与分析

2.1 性状鉴别结果

菌粉呈粉末状，米黄色至深黄色，粉末无明显气味，触感细腻.

2.2 质量标准实验结果

2.2.1 发酵菌丝体产量

根据5批样品测定结果，菌丝体产量在23.11～27.31 g/L区间.以5批样品平均产量的85%作为下限列入质量标准，因此暂定每升发酵液中菌粉干重不少于20.80 g.

2.2.2 腺苷含量

腺苷色谱结果(图1)所示，在10 min时腺苷标准品与菌粉都有吸收峰.

5批样品腺苷测定结果，含量范围在2.93～3.41 g/kg之间，以最低含量的85%计入质量标准，因此暂定腺苷含量不少于0.27%.

a 样品;b 腺苷对照品 图1 样品和腺苷对照品色谱图Fig.1 The chromatograms of Paecilomyces hepialid and adenosine reference substance

2.2.3 一般杂质含量

表1为一般杂质检查结果，以5批样品中杂质平均含量的150%作为上限列入质量标准.将水分含量不超过6.71%，总灰分含量不超过1.26%，酸不溶性灰分含量不超过0.15%列入本品质量标准正文检查项下.

表1 蝙蝠蛾拟青霉一般杂质含量Tab.1 The normal impurity content of Paecilomyces hepiali

2.2.4 重金属含量结果

菌粉中重金属含量检测结果(表2)，含量均小于国家保健(功能)食品通用标准GB16740—1997规定或低于中国药典标准，故重金属未列入质量标准正文检查项下.

表2 蝙蝠蛾拟青霉重金属含量Tab.2 The heavy metals content of Paecilomyces hepiali

2.3 小鼠免疫增强实验结果

2.3.1 小鼠脏器指数测定结果

0.3、1.5、3.0 g/kg蝙蝠蛾拟青霉组小鼠的脾脏指数与空白对照组比较均无显著性差异(图2)，蝙蝠蛾拟青霉对小鼠脾脏指数无显著影响(p>0.05).

2.3.2 迟发型变态反应

足趾肿胀度(DTH)结果显示(图3)，0.3 g/kg、1.5 g/kg和3.0 g/kg蝙蝠蛾拟青霉给药组与空白对照组相比肿胀程度差异显著(p<0.01)，没有明显的剂量依赖性.表明蝙蝠蛾拟青霉具有增强机体迟发型变态反应的作用.

2.3.3 免疫细胞因子测定结果

从表3可以看出，蝙蝠蛾拟青霉对IL-10、IL-12、IL-12R、IFN-α 等细胞因子水平有显著上调作用(p<0.05)，其中3.0 g/kg蝙蝠蛾拟青霉组效果最显著.

图2 小鼠脾脏指数测定结果Fig.2 Spleen index in mice

与空白对照组相比，**p<0.01

表3 免疫相关细胞因子表达测定结果Tab.3 Expressions of immune related cytokines

注：与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01

3 结语

本文建立了蝙蝠蛾拟青霉100 L发酵菌丝体质量标准.将菌丝体产量不少于20.80 g/L，腺苷含量不少于0.27%，水分含量不超过6.71%，总灰分含量不超过1.26%，酸不溶性灰分含量不超过0.15%，重金属含量少于国家标准计入蝙蝠蛾拟青霉100 L发酵菌丝体的质量标准正文.

本文利用小鼠免疫增强实验，检测蝙蝠蛾拟青霉100 L发酵菌丝体的免疫增强活性，结果显示100 L发酵菌丝体对小鼠脾脏指数无显著影响，且能显著增强小鼠超敏反应，提高IL-10、IL-12、IL-12R、IFN-α 等炎症因子含量，证实蝙蝠蛾拟青霉100 L发酵菌丝体体内安全性和有提高小鼠细胞免疫功能，减轻机体炎症反应的作用.

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Research on the Quality Standard and the Immunoregulation Function ofPaecilomycesHepialid

ZhouYulin1,LiLanzhou1,HuWenji1,TengWeizhuo1,ZhengDeqing2,LiuYang1

(1 College of Life Sciences, Jilin University, Changchun 130022,China;2 Centre School of Mushihe Town,Changchun 130508,China)

Objective: Aim to establish the quality standard of the 100 L FermentationPaecilomyceshepialidmycelium, and study on the safety and immunoregulation activity.Methods: With HPLC and other methods，detect the content of moisture, the general impurities, acid insoluble impurities and heavy metals basing on the output and adenosine concent of the mycelium to set up the quality standard.At the same time, the safety and immune regulation activity were determined by the immunological experiment of mice.Results: Mycelium yield is more than 20.80 g/L, adenosine is more than 0.27%, moisture content is less than 6.71%, total ash is less than 1.26% and acidinsoluble ash is less than 0.15% and heavy metal is less than mandatory standard as the quality standard.Meanwhile, the immunological experiment results show thatPaecilomyceshepialidmycelium could observably improve the DTH reaction and improve the content of IL-10, IL-12, IL-12R and IFN-α.Conclusions: The quality standard of 100 L FermentationPaecilomyceshepialidmycelium is established, and the safety and immunoregulation function in mice are approved.

Paecilomyceshepialid;fermentation;quality standard;immunoregulation

2017-02-15 *通讯作者 刘 洋，研究方向：生理药理研究.E-mail:llz1604397692@163.com

周毓麟(1983-)，男，工程师，博士，研究方向：药剂与分子药理研究.E-mail: zhouyl133@jlu.edu.cn

吉林省科技发展计划项目(20130201006ZY)

TQ920.1;R932；R927.11

A

1672-4321(2017)01-0024-04