基层使用酶联免疫法检测仪器的注意事项

边腊红 徐华超 四川省凉山彝族自治州农产品质量安全检测中心 615000

基层使用酶联免疫法检测仪器的注意事项

边腊红 徐华超 四川省凉山彝族自治州农产品质量安全检测中心 615000

基层检测单位由于经费有限、技术力量薄弱，在开展兽药残留检测时需要考虑检测技术和成本等因素。酶联免疫法具有操作简便、样品处理量大、灵敏度高、仪器化程度低和分析成本低等优点，目前成为了各级基层检测单位检测兽药残留最理想的检测技术之一。本文主要阐述基层检测兽药残留使用酶联免疫法所需的主要仪器及注意事项。

基层检测；兽药残留；酶联免疫法；仪器

兽药残留是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及（或）其代谢物，以及与兽药有关的杂质。对人体健康影响很大。主要有毒性反应、诱导产生耐药菌株和三致作用(致畸、致癌、致突变)[1]。因此，对兽药残留进行广泛、快速、准确的检测很有必要。

目前检测兽药残留的方法很多，但是大多数需要昂贵的仪器设备，操作繁琐，成本很高。基层检测单位由于经费、人员有限，技术力量薄弱，在开展兽药残留检测时就需要考虑检测成本及技术水平等。酶联免疫吸法具有操作简便、样品处理量大、灵敏度高、重现性好、仪器化程度低和分析成本低等优点，目前成为各级基层检测单位检测兽药残留最理想的检测技术之一，展示了良好的应用前景[2]。

1 离心机

ELISA前处理操作中离心机要能进行50mL离心管离心，非冷冻也可以。离心机要能够提供实验所需的离心力（Fr）： Fr=11.19×(rpm/1000)2×r×g。 Fr越大，越有利于分离。一般实验操作要求的3000g即为离心力。使用离心机前，先看使用注意事项；在操作时，要保证离心管对称放置。

2 移液器

移液器一般使用 50～1000μL、50～300μL 八通道排枪。 ELISA 加样量小（20～200μL），其准确性直接影响实验结果，利用称重法校准：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，用万分之一的天平称重后计算是否准确，一般误差在±5%以内。实际操作过程中，移液器提倡用“吸二打一”。其优势在于，在加样过程中在板孔内不出现或者很少出现气泡，能够提高加样速度，缩短前后样本反应的时间差。

3 氮吹仪

它是利用氮气的快速流动打破液体上方的气液平衡，从而使液体挥发速度加快；并通过升高温度，进而达到浓缩的目的。

注意事项：针头悬于液面上方，不可接触液面；气流调试平稳后，再放入样本；加热系统温度设置在规定范围内。

4 酶联免疫试剂盒[3-6]

酶联免疫试剂盒是兽药残留检测的核心仪器，它的优劣在很大程度上影响着检测的准确性，因此在实验前对试剂盒的下列指标注意考查，与提供的参数进行比对，做出评判。

（1）标准曲线。标准曲线的好坏，将会影响到最后的实验结果，因此通过标准曲线可以考察试剂盒的相关系数和抑制率。

试剂盒中含有不同浓度的标准溶液，标准曲线至少由5个浓度组成，测定次数不少于5次，以确定工作浓度范围和IC50范围，药物最大残留限量（MRL）必须在曲线范围内。其中IC50是标准曲线50%的抑制浓度,是反映试剂盒灵敏度的指标，IC50的数值越小，灵敏度越高。标准曲线的线性相关系数≧0.98。

工作浓度范围通过阴性、临界值浓度和阳性的样品测定来确定，每个浓度重复不少于5次。

（2）检出限和定量限。检测限为20份空白样品测定均值加3倍标准差。定量限应大于标准曲线中最低浓度点。应对该浓度样品至少测定6次以进行验证，而不能通过外延法推断。

（3）精密度和准确度。对于有最高残留限量的药物，添加浓度为MRL及MRL上下各一个浓度；对于禁用药物，添加浓度为定量限和2倍定量限，每个添加浓度至少测定5个平行样，并至少进行3批实验（不同检测日期，不同标准曲线，不同批次的试剂盒）。

准确度为回收率范围大于40%或符合相应检测标准的要求；精密以变异系数表示；批内变异系数，每批平行样之间的变异系数≦25%，禁用药物≦30%。

批间变异系数：所有样品之间的变异系数≦30%，禁用药物≦40%。定性方法为阴性和阳性样品各测定不少于50份，确定假阳性率和假阴性率。假阳性率=假阳性÷（假阳性+真阴性），假阴性率=假阴性÷（假阴性+真阴性），一般要求假阳性率≦5%，假阴性率为0。

（4）特异性。在试剂盒中，特异性常用交叉反应率表示。与待测药物相似结构的物质可能和酶标板上的抗原结合，产生交叉反应，使测定结果升高，还可能成为假阳性。对于检测单一药物的试剂盒，其他相似药物的交叉反应率越低，表明试剂盒特异性越强。

（5）产品外观。观察试剂盒外包装是否有产品名称、生产厂家、型号、批号和生产日期等标识，以及盒内是否有说明书、质控检验单等，若其中多项空白则需注意，可能该试剂盒为不合格产品。盒内封装试剂在正常情况下应该是澄清、透明的液体，不应出现结晶、絮状物或沉淀。取出试剂盒在常温下回温30分钟，观察试剂瓶里的试剂是否有标签脱落、漏液现象。

需特别注意的是试剂盒应保存于2～8℃条件下，不要冷冻，将不用的微孔板放回铝箔袋重新密封。标准物质和无色底物液对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。试剂盒使用前应先从冰柜里取出，室温下放置30分钟以上，以减少边缘效应对结果的影响。试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致吸光度值和灵敏度发生变化，会直接影响检测结果。反应终止液为高浓度硫酸，避免接触皮肤。

5 恒温培养箱

它主要是为实验中的酶联免疫反应提供恒温的环境。要经常检查恒温箱温度计所示温度和温箱内实测温度是否一致，允许有±1℃的误差。

6 酶标仪

酶标仪是对酶联免疫检测实验结果进行读取和分析的专业仪器。在检测前将酶标仪预热30分钟。在酶标仪测定每孔的值时，应在5分钟内读完。经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。

7 结语

仪器是实验室检验、检测活动最直接的工具和重要的基础设施及关键资源，是检测机构开展检测工作所必需的物质基础,也是国家有关部门对检测机构进行验收、审查认可、计量认证等行政管理时必须考核的硬件内容。有了这些仪器，基层检测单位就能够开展兽药残留的定性和定量工作，能够为当地政府部门了解当地畜禽产品现状提供数据支撑。

[1]贺家亮，李开雄，等.动物性食品兽药残留现状及对策[J].中国动物检疫，2006，23(7)：22-24.

[2]邢应寿，祁克宗.ELISA技术在畜产品安全检测中的应用[J].动物医学发展，2004，25（3）：19-22.

[3]农业部文件农医发[2005]17号.关于发布兽药残留ELISA试剂（盒）备案审查技术资料要求和“兽药残留ELISA试剂（盒）备案参与评判标准”的通知[Z].

[4]伏慧明，郭展旗,等.兽药残留检测中试剂盒的验证评判方法研究[J].中国农业科技导报，2008，10（S2）：109-111.

[5]王丽娜，郝利忠,等.兽药残留检测中酶联免疫试剂盒的选择原则与使用注意事项[J].现代畜牧兽医，2013（7）：41-44.

[6]刘冬梅，蒲明.选择兽药残留酶联免疫试剂盒的关键因素[J].现代农业科技，2015（20）：258，260.