乳制品中益生菌的定量方法研究进展

张娜娜, 姜 凯, 赵 渝, 刘 洋, 段文锋

(1.上海师范大学 生命与环境科学学院 植物种质资源开发协同创新中心,上海 200234;2.上海市质量监督检验技术研究院/国家食品质量监督检验中心(上海),上海 200233)

乳制品中益生菌的定量方法研究进展

张娜娜1, 姜 凯1, 赵 渝1, 刘 洋2*, 段文锋2

(1.上海师范大学 生命与环境科学学院 植物种质资源开发协同创新中心,上海 200234;2.上海市质量监督检验技术研究院/国家食品质量监督检验中心(上海),上海 200233)

益生菌对健康有促进作用,乳制品中的益生菌的数量已成为评价其质量优劣的重要标准.建立简单快速益生菌定量检测方法很有必要.就乳制品中益生菌数量测定方法的研究现状和发展趋势进行了综述.

乳制品; 益生菌; 定量方法; 检测

0 引 言

近年来“益生菌”这一名词的热潮只升不降,Fuller等[1]凭借有益菌对人及动物肠道的感化作用,把“一种能经过改良肠道微生物的均衡而对宿主产生有利影响的微生物添加物”定义为益生菌,它对人和动物体都有重要的益生作用.益生菌基本都对其宿主有有益影响,主要功效为帮助消化,调节肠道菌群平衡,治疗腹泻和便秘,降低血液胆固醇水平,增强宿主免疫功能和抗肿瘤等[2-5].益生菌能可帮助人体吸收营养物质[6-7].

乳制品中益生菌的数量是其产品发挥益生功效的重要条件,成为产品安全和功能性试验的重要参数[8-9].《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》[10]中规定添加益生菌的乳制品中其添加量至少要达到1×106CFU/mL.本文作者介绍了目前常见的乳制品中益生菌数量的测定方法.

1 培养法

平板培养法是乳制品中益生菌测定的标准方法,也是目前实验室中最常用的方法.其基本原理是:将待测样品进行梯度稀释使其中的微生物呈现为稳定的、均匀的单细胞状态,然后取合适的量接种到加热灭菌的培养基上,经培养,单个细菌生长为一个菌落.计算时根据稀释度和接种量换算成样品中的菌落总数[11].益生菌有好氧菌、厌氧菌和兼性厌氧菌之分,培养过程中注意培养方式,会使样品中的菌落总数更加准确.

发酵乳制品中添加量较多的几种菌有:双歧杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌.各菌种的特殊培养计数方法如下.

保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵菌一般会同时出现在一种乳制品中[12],为更快、更方便地对保加利亚乳杆菌计数并减少在培养过程中杂菌的生长,鲁慧峰等[13]对乳酸细菌培养基(MRS培养基)进行优化,即在培养基中加入醋酸,将pH值调制5.4,使培养基酸化,从而保证在混合菌种中只生长保加利亚乳杆菌.

双歧杆菌是厌氧型菌种,与其他菌混合时可以被简单快速地在选择性培养基中区分鉴别出来.国标GB 4789.35-2016中双歧杆菌计数方法是在MRS培养基中添加莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐,接种过后厌氧培养[7].Thitaram等[14]通过在选择性培养基中添加莫匹罗星这种抗生素可以很好地将双歧杆菌分离出来,并进行计数.

干酪乳杆菌的选择性计数可使用乳杆菌培养基(LC琼脂)[15],Talwalkar等[16]证明了这一培养基可以被广泛地用在含有干酪乳杆菌的益生菌制品中.Colombo等[17]研究了在选择性平板上加入10 mg/L的万古霉素,可以将发酵乳中的干酪乳杆菌鉴别并计数.

嗜酸乳杆菌是乳制品中添加量较多的益生菌,但一般与其他菌混合存在.研究证明MRS-山梨醇在厌氧条件下只允许嗜酸乳杆菌生长,利用MRS-山梨醇培养基可以在多菌种存在的乳制品中选择性计数目标菌[18].另外也可以在MRS培养基中添加克林霉素(体积分数0.02%)至其体积分数为0.05%,添加环丙沙星(体积分数0.2%)至其体积分数为0.5%,可抑制保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌等的生长[16].但这种方法只适用于乳制品中嗜酸乳杆菌含量不低于104CFU/g的情况.克林霉素和环丙沙星添加过多也会抑制嗜酸乳杆菌的生长,导致计数偏低.培养法可以很好地计数活菌的信息,但对于死菌或受损菌则无法计数,而且培养法操作繁琐,耗时长,结果易受多因素影响.

2 腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)生物荧光法

ATP是生命的能量来源,存在于活细胞中,含量相对稳定,但细菌死后几分钟内ATP便被水解,故而ATP与活菌量有直接联系[19].生物荧光法的原理是:荧光素酶将荧光素、氧和ATP作为底物,产生荧光现象[20].自1850年代开始用于食品微生物检测,并且在1990年代开始迅速发展[21].此方法在动物、植物、微生物及医药领域的检测中都有着广泛的应用[22-23].ATP在食品中的应用主要是检测食品中的细菌总数,并逐渐发展到检测乳制品中益生菌的总数.Wu等[24]优化了ATP快速定量检测方法,并确认可以快速测定固体或液体益生菌产品中细菌的活菌数.陈艺虹[25]对啤酒中乳酸菌和酵母菌进行了检测,发现此方法可以快速方便地对细菌进行定量检测,但是只能对活的细菌进行定量,而对于灭活的细菌没有作用.

3 电子阻抗法

电子阻抗测量法的基本原理是:微生物在生长过程中能够使培养基中的阻抗和电极周边的双电层电极阻抗产生转变,这种变化与微生物的数量相关[26].黄吉城等[27]运用电子阻抗法测定食品中的菌落总数,并与国标法相对比得出其差异性不大,但检测时间缩短了很多.杜寒春等[28]将此方法运用到巴氏杀菌牛乳的菌落总数测定并绘制了标准曲线,得出其相关系数为-0.9907,可信度较高.顾其芳等[29-30]将电子阻抗法应用到食品的乳酸菌定量中,对324份样品检验并绘制相关曲线,得相关系数为0.95,用时仅为18 h,证明此方法在乳酸菌的定量中具有很好的应用性.此方法与平板计数法相比,结果无显著差异,且重现性较好、灵敏度高,具有广泛的实用性和适用性[28].

4 聚合酶链式反应(PCR)

PCR反应技术是在体外发生的一种极速扩增核酸数目的方法,它能使微量的核酸在一个较短时间内成倍数地扩增[31].只要选择合适的引物,PCR就可以特异性地扩增出目标物的某一段比较保守的基因片段,从而达到特殊检测的目的[32].该方法已在食品的益生菌检测中广泛使用[33-34].

技术的不断发展使得PCR技术与其他新兴技术结合,产生了一些以PCR技术为基底的衍生技术,包括:荧光定量PCR(RTQ-PCR)、多重PCR(M-PCR)、逆转录PCR、PCR-ELISA技术、PCR-DGGE技术、Lamp技术等.这些PCR衍生技术主要用于某一样本中的微生物定性或微生物的菌群分布研究[35-38].荧光定量PCR目前在微生物定量检测中应用较为广泛.

荧光定量PCR的基本原理与普通PCR相似,只是在扩增的同时通过荧光染料或荧光标记的具有特异性的探针,跟踪标记PCR产物,实时监测反应过程并结合相应的软件分析,计算待测样品模板的浓度,最后通过标准曲线对未知模板逆推得出样品的含量.其分为绝对定量和相对定量两种.相对定量是分别对目的基因和参比基因定量测定,再求出相对于参比基因的目的基因的相对量,最后再进行样品间相对量的比较[39].绝对定量是对未知样品的绝对量进行测定的方法,通过一系列稀释已知浓度的标准品制作标准曲线,对未知浓度的样品进行其拷贝数的测定,所使用的标准品可以是dsDNA、ssDNA或cDNA[40].根据这些原理郭子好等[41]将TR-PCR应用到发酵物料中嗜酸乳杆菌的数量,并且准确地检测出样品中菌含量为1.5×109CFU/g.斯日古冷[42]通过16S rRNA序列对发酵乳中的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)进行定量检测,并准确检测出样品中的植物乳杆菌数.Furet等[39,43-45]对乳制品中的益生菌进行定量检测,其样品中菌含量最少是106CFU/mL,检测限为103CFU/mL.其最大的优势是不仅可以定量乳制品中的活菌数,而且可以为灭活菌定量.

5 流式细胞术(FCM)

FCM是一种在细胞分子水平上通过单克隆抗体或染料染色后对单个细胞或其他的生物粒子进行快速定量分析的技术[46].目前已广泛应用于食品、饮料等领域.Hahne等[47-48]将FCM应用于食品、饮料行业进行酵母菌、霉菌和食品中其他细菌的计数.Bunthof等[49]研究了乳制品中乳酸菌染料染色后所表现出的活力程度,表明FCM可以明确地将活、死细胞区分开来.Cassoil[50]研究发现FCM与标准的平板计数法相比在数值上会有很大的差异,但是其差异不会超过一个数量级.平板计数法只可以将活性较好的菌培养出来并计数,流式细胞术则是将受损但未死亡的细胞也计算在活细胞范围内,导致计数结果差异较大.另外,杨莉婷等[51]利用FCM对生乳中细菌总数计数时,其检测限达到了10 CFU/mL,且与平板计数法结果比较发现具有显著的相关性(P<0.01).FCM操作简便,检测周期短,能够区分活死菌,适合乳制品中益生菌的计数.

6 结束语

本文归纳总结了5种乳制品中乳酸菌的检测方法.培养法是现行的国家标准,但培养法只能培养活性较好的细菌,对于活性较差或不可培养细菌无法计数;ATP法和电阻法可以对活菌进行准确快速的检测,且置信度高,但也不能对死菌进行检测;PCR方法是目前在乳制品中乳酸菌定量检测使用较多的定量方法,不但可以对活菌进行定量,还可以通过建立标准曲线对死菌进行定量,另外根据引物的不同也可以对单一菌种进行定量;FCM通过使用荧光染料对细菌进行标记从而快速地区分活菌和死菌,但不能达到对单一菌种进行检测的要求.研究人员可根据需求选择合适的定量检测方法,在减少检测时间的同时提高检测效率.

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(责任编辑:顾浩然,冯珍珍)

Advancesinquantitativedetectionmethodsofprobioticsindairyproducts

Zhang Nana1, Jiang Kai1, Zhao Yu1, Liu Yang2*, Duan Wenfeng2

(1.Development Center of Plant Germplasm Resources,College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China; 2.Shanghai Institute of Quality Inspection andTechnical Research/National Center of Supervision and Inspection on Food Products Quality (Shanghai),Shanghai 200233,China)

Plenty of studies showed the probiotics can promote health.The number of probiotic bacteria in probiotic dairy products has become an important criterion for evaluating the produces′ quality.Therefore,it is necessary to establish a simple and rapid method for quantitative determination of the probiotics in dairy products.In this paper,the research status and development trend of quantitative determination method of probiotics in dairy products are summarized.

dairy products; probiotics; quantitative method; detection

N 34

A

1000-5137(2017)05-0751-06

2017-08-31

国家自然科学基金(31301486);上海市自然科学基金(13ZR1439600);上海市2017年度“科技创新行动计划”(17142203000);上海植物种质资源工程技术研究中心项目(17DZ2252700)

张娜娜(1992-),女,硕士研究生,主要从事食品微生物及应用方面的研究.E-mail:znsh@163.com

导师简介: 赵 渝(1973-),男,博士,副教授,主要从事食源性致病菌快速检测方面的研究.E-mail:zhaoyu@shnu.edu.cn

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刘 洋(1980-),女,高级工程师,主要从事生物学技术在食品检测中的应用方面的研究.E-mail:liuyang@sqi.org.cn