阿莫西林克拉维酸钾亚最低杀菌浓度体外诱导细菌耐药试验研究

陈红红，蔡红，谭华

阿莫西林克拉维酸钾亚最低杀菌浓度体外诱导细菌耐药试验研究

陈红红1，蔡红1，谭华2

（1.南昌市第一医院药剂科，江西 南昌 330000；2.鹰潭市人民医院铁路分院检验科，江西 鹰潭 335000）

目的 探讨阿莫西林克拉维酸钾最低杀菌浓度体外诱导细菌耐药试验研究。方法 将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213作为研究对象，将阿莫西林克拉维酸钾作为抗菌药物，检测方法是以微量稀释法来定量测定经过特定诱导天数时的MBC值，用1/2MBC浓度来对金黄色葡萄球菌进行多步体外诱导试验共34天，并对试验结果金黄色葡萄球菌株MBC的变化进行记录，使用全自动微生物药敏鉴定仪来分析诱导后金黄色葡萄球菌株进行阿莫西林克拉维酸钾耐药性试验结果。结果 金黄色葡萄球菌标准菌株的MBC值经过阿莫西林克拉维酸钾体外诱导试验，在第9天时MAC值明显升高，在经过34天诱导后MBC值是标准菌株MBC值的32倍，Pearson相关系数显示亚MBC抗菌药物时间和标准菌株的耐药性呈正相关性（r=0.715，P＜0.001）。诱导出的金黄色葡萄球菌株对阿莫西林克拉维酸钾药物100%耐药。结论 亚MBC阿莫西林克拉维酸钾能够体外诱导金黄色葡萄球菌耐药菌株，其耐药性跟诱导时间成正比。

阿莫西林克拉维酸钾；亚最低杀菌浓度；体外诱导；细菌耐药

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准菌株 金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213，江西省临床检验中心提供金黄色葡萄球菌标准菌株。

1.1.2 抗菌药物 阿莫西林克拉维酸钾。规格1.5 g/支，阿莫西林与克拉维酸钾比例是4∶1，药品批号20140316，购自哈尔滨制药有限公司。

1.1.3 主要试剂及设备 主要采用M-H肉汤细菌培养液，自行配置，主要成分有酪蛋白17.5 g、淀粉1.5 g、加牛肉汤600 mL、蒸馏水400 mL和50 mL羊血。主要设备有麦氏标准比浊管，购自北京天安联合科技有限公司；DHP-9160型恒温37℃细菌培养箱，购自山东博科生物产业有限公司。BSC-1100IIA2-X系生物安全柜，购自苏州长留净化科技有限公司。VITEK-2 COMPACT全自动药敏鉴定分析仪和药敏板条均购自北京兰伯瑞生物有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌标准菌株液的制备 将金黄色葡萄球菌标准菌株放置在生物安全柜中进行解冻，解冻后，在无菌操作条件下，先将金黄色葡萄球菌标准菌株接种在M-H琼脂固体培养基上复活，然后再用接种环挑取少量菌液接种在M-H肉汤培养基中，置于37℃恒温细菌培养箱中培养24 h，用麦氏标准比浊管稀释金黄色葡萄球菌至浓度为1×105cfu/mL,作为备用液。

1.2.2 微量稀释法测定MBC 金黄色葡萄球菌标准菌株MBC值检测方法采用的是微量稀释法[5]。

无菌环境下进行下先用M-H细菌培养液在12×8孔聚苯乙烯无菌微孔培养板中将阿莫西林克拉维酸钾进行分别的稀释，再加入金黄色葡萄球菌标准菌株，使阿莫西林克拉维酸 钾 的 浓 度 为 1 024μg/mL、512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL，而金黄色葡萄球菌标准菌株的终浓度为1×105cfu/mL。在试验的同时进行空白对照孔和生长对照孔，空白对照孔仅仅是加入M-H细菌培养液，生长对照孔则只有M-H细菌培养液和细菌液，没有抗菌药物。放在37℃恒温细菌培养箱中培养24 h。再取没有沉淀浑浊的细菌培养液，按照三线法操作方法接种在M-H琼脂固体培养基上，继续37℃恒温细菌培养箱中培养24 h后观察是否有细菌生长。低剂量抗菌诱导后细菌的会有耐药性的发生，将M-H琼脂固体培养基上没有细菌生长的抗生素最小浓度作为MBC。根据此方法进行细菌耐药性发生的MBC，试验对同一个菌株进行5次平行试验，其中MBC值全部发生变化，最终结果才能确定耐药性诱导后的金黄色葡萄球菌株MBC值。

1.2.3 多步骤诱导耐药菌株的建立 将依据上述方法检测到金葡菌标准菌株的MBC值，记录为MBC0。然后取10μL金葡菌标准菌株备用液加到5.0 mL M-H液态培养基中，加入阿莫西林克拉维酸钾浓度是0.5 MBC0，放置在37℃恒温细菌培养箱中培养24 h后，检测诱导后葡萄球菌标准菌株MBC值，如果测出来的MBC值不改变的话，阿莫西林克拉维酸钾浓度也不需要改变，继续培养并测定标准菌株的MBC值，对比数据观察MBC值是否有变化。经过多次诱导培养细菌后金黄色葡萄球菌标准菌株发生变化，为MBC1，加入阿莫西林克拉维酸钾浓度则为0.5 MBC1，继续培养诱导并检测MBC值，金黄色葡萄球菌标准菌株再次发生变化，为MBC2,稀释抗菌药物浓度为0.5 MBC2，按照此种方法连续进行34 d的诱导试验进行，记录好金黄色葡萄球菌标准菌株MBC值以及变化趋势诱导所需时间。

1.2.4 耐药菌株的鉴定 按照本研究方法诱导的耐药菌株在M-H液态培养基（不含任何抗菌药物）中培养，再细菌稳定传代3次后，采用麦氏标准比浊管将传代菌液配置浓度为1×105cfu/mL，采取VITEK-2 COMPACT全自动药敏鉴定分析仪进行检测。重复10次的测试观察对阿莫西林克拉维酸钾是否耐药，并与诱导前金葡菌标准菌株耐药性进行比较。

2 结果

2.1 阿莫西林克拉维酸钾MBC诱导时间与耐药性的观察初始阿莫西林克拉维酸钾MBC0值为2.0μg/mL，经过浓度为1.0μg/mL阿莫西林克拉维酸钾的诱导9 d后，发现金黄色葡萄球菌标准菌株发生变化，升到了4.0μg/mL（MBC1）。在11 d时开始用浓度为2.0μg/mL阿莫西林克拉维酸钾的诱导，在诱导19 d的时候，发现金黄色葡萄球菌标准菌株发生变化，升到了8.0μg/mL（MBC2）。开始从第20天浓度为4.0μg/mL抗菌药物的诱导，继续诱导到25 d时可发现标准菌株发生了变化，升到了16.0μg/mL（MBC3）。继续增加阿莫西林克拉维酸钾诱导剂浓度，在31 d和34 d时黄色葡萄球菌标准菌株发生变化，分别升到了32.0μg/mL（MBC4）和64.0μg/mL（MBC5）。实验结果可以清楚看到随着亚MBC抗菌药物诱导时间的不断增加，金葡菌标准菌株耐药性也相应增大，经过34 d的亚MBC阿莫西林克拉维酸钾诱导，金黄色葡萄球菌标准菌株耐药性增加了32倍。Pearson相关系数显示亚MBC抗菌药物时间和标准菌株的耐药性呈正相关性（r=0.715，P＜0.001）。

2.2 经过亚MBC阿莫西林克拉维酸钾诱导的耐药菌株对阿莫西林克拉维酸钾的耐药率 本实验经过亚MBC阿莫西林克拉维酸钾诱导出金黄色葡萄球菌传代菌的耐药性，通过VITEK-2 COMPACT全自动药敏鉴定分析仪检测发现对阿莫西林克拉维酸钾的耐药率为100%，而未经诱导的金黄色葡萄球菌菌株耐药率为0%。

3 讨论

临床上细菌感染患者通过不合理使用抗菌药物会导致细菌的耐药性不断增加。不合理药物使用主要有抗菌药种类和抗菌药物剂量的滥用，这些不合理的药物使用导致了细菌耐药性产生[6]。临床患者感染的细菌产生耐药性问题已经引起了社会广泛的重视，超级耐药菌的产生对抗菌药物临床疗效也产生了严重的影响[7]。透彻研究细菌产生耐药性的机制，可以为临床抗菌药物的使用及防止细菌发生耐药性提供临床依据。金黄色葡萄球菌标准菌株常用于微生物临床试验的细菌药敏研究，其对多种的抗菌药物有高度敏感性或耐药性[8]。在临床试验中，可以将抗菌药物突变选择窗作为临床上选择抗菌药物治疗剂量选择的一个重要依据。况且研究表明临床上细菌出现耐药性现象，并不是突变导致的，而是一个慢慢积累的过程，从而导致细菌对抗菌药物敏感演变为耐药[9-10]。

本研究采用微量稀释法测定阿莫西林克拉维酸钾MBC值，多步骤诱导建立耐药菌株。实验结果显示，金黄色葡萄球菌标准菌株耐药性与亚MBC阿莫西林克拉维酸钾诱导时间呈时间依赖性关系，经过34天的亚MBC阿莫西林克拉维酸钾诱导，金黄色葡萄球菌标准菌株耐药性增加了32倍。而Pearson相关系数显示亚MBC阿莫西林克拉维酸钾时间和标准菌株的耐药性呈正相关性。经过诱导的耐药菌株对阿莫西林克拉维酸钾的耐药率为100%，而未经诱导的金黄色葡萄球菌菌株耐药率为0%。经本实验研究可知，长期使用低剂量的抗菌药就会发生细菌耐药性，使抗菌药失去本有的作用，为了尽量避免此类事件的发生，减少细菌耐药性，因此要对药剂的使用进行合理控制。

综上所述，本研究证实亚MBC阿莫西林克拉维酸钾长时间诱导会导致标准菌株产生耐药性。因此，临床要合理使用药物剂量和时间，以免患者体内致病菌产生耐药性，影响患者治疗效果。

[1] 李媛媛,陈建卓,王润,等.以近视首诊的青少年开眼型青光眼78例临床分析[J].东南国防医药,2014,16(3):302-303.

[2] 陈荣剑.阿莫西林克拉维酸钾亚最低杀菌浓度体外诱导细菌耐药试验研究[J].解放军医药杂志,2015,27(7):85-87.

[3] Penwell WF,Shapiro AB,Giacobbe RA,et al.Molecular Mechanisms of Sulbactam Antibacterial Activity and Resistance Determinants in Acinetobacter baumannii[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2015,59(3):1680-1689.

[4] Hu Q,Cheng H,Yuan W,et al.Panton-Valentine leucocidin(PVL)-positive health care-associated methicillin-resistant Staphy-lococcus aureus lsolates Are Associated with skin and soft tissue in-fections and colonized mainly by infective PVL-encodingbacterio-phages[J].JClinMicrobiol,2015,53(1):67-72.

[5] 孙同祖.烧伤外科与非烧伤外科住院患者细菌感染特点及耐药性的对比研究[J].当代医学,2017,23(3):102-103.

[6] 周家军,梁蓓蓓,王睿,等.利奈唑胺与万古霉素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌体外抗菌活性[J].中国临床药理,2010,26(8):593-596.

[7] Zhang B,Gu X,Li Y,et al.In vivo evaluation of mutant selection window of cefquinome against Escherichia coli in piglet tissue-cage model[J].BMC Vet Res,2014,10(1):297.

[8] 庞载元,吴贤丽,敖茂程,等.14种市售抗菌药对金黄色葡萄球菌标准菌株的体外抑菌作用[J].中国执业药师,2014,12(11):20-22.

[9] Plantinga NL,Wittekamp BH,van Duijn PJ,et al.Fighting antibiotic resistance in the intensive care unit using antibiotics[J]. Future Microbiol,2015,10(2):391-406.

[10]Hong BK,Winer JC,Martone JF.Repeat selective laser trabeculoplasty[J].J Glaucoma,2009,22(11):180-183.

Experimental study on bacterial resistance of amoxicillin and clavulanate potassium in vitro

Chen Hong-hong1,Cai Hong1,Tan Hua2
(1.Department of Pharmacy,Nanchang First Hospital,Nanchang,Jiangxi,330000,China;2.Department of Clinical Laboratory,Yingtan People's Hospital railway,Yingtan,Jiangxi,335000,China)

Objective To investigate the antibiotic resistance of amoxicillin and clavulanate potassium in vitro.Methods The standard strains of Staphylococcus aureus ATCC29213 as the research object,the amoxicillin and clavulanate potassium as antimicrobial agents,the detection method is determined by the specific induction of days when the value of MBC by micro dilution method to quantitative,with the concentration of 1/2 MBC for multi step test for 34 days in vitro of Staphylococcus aureus,and change the test results of Staphylococcus aureus strain MBC were recorded to analyze the induction of Staphylococcus aureus strains of amoxicillin and clavulanate potassium resistance test results using automated microbial susceptibility testing instrument.Results The standard strains of Staphylococcus aureus MBC value after amoxicillin and clavulanate potassium in vitro test in 9 days when the MAC value increased significantly,after 34 days of induction when the MBC value is 32 times the standard strain of MBC,Pearson correlation coefficient showed a positive correlation between sub-MBC antimicrobial drug time and drug resistance(r=0.715,P＜0.001),induced by Staphylococcus aureus strains of amoxicillin and clavulanate potassium 100%drug resistance.Conclusion MBCAmoxicillin clavulanate can induce Staphylococcus aureus resistant strains in vitro,and its drug resistance is proportional to the induction time.

Amoxicillin clavulanate potassium;Minimum bactericidal concentration;In vitro induction;Bacterial resistance

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.36.010

临床不合理使用抗菌药物导致细菌的耐药性不断增加，细菌产生耐药性的原因及发生机制的研究已经越来越受到国内外研究学者的关注[1]。抗菌药物种类和剂量的不合理使用是耐药性产生的主要原因。相关研究表明，低浓度抗菌药物会通过体外诱导使临床患者感染菌株产生细菌耐药[2]。在医院里，耐甲氧西林和其他抗生素的细菌的广泛流行，给临床抗感染治疗带来了很大问题。耐药性菌除了可以引起机体感染外，还可以通过肠毒素污染食物而引起食物中毒，加重公共卫生负担。金黄色葡萄球菌是感染者患者常见的致病菌之一，它能产生许多不同毒素因子从而使人类感染患病，如杀白细胞素能够破坏人体内的白细胞和巨噬细胞从而导致皮肤软组织感染、骨髓坏死及坏死性肺炎等[3]。因此选择金葡菌作为研究对象具有重要的临床意义。临床研究证实阿莫西林克拉维酸钾是临床常用且有效的抗感染药物[4]，因此利用阿莫西林克拉维酸钾亚最低杀菌浓度（mininal bactericidal concentration，MBC）对于标准菌株的体外诱导培养情况来探讨MBC抗生素可导致耐药性的发生是有临床意义。虽然国内已有相关研究，但体外诱导的时间和剂量不一，本研究旨在MBC抗生素对于临床耐药性发生提供新的实验数据。