传统乳制品来源乳酸菌的发酵特性及其在酸奶中的应用

曹永强,张 健,余志坚,陈 超,周 梅,宗艳丽,杨贞耐,*

(1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,食品质量与安全北京实验室,北京工商大学,北京 100048; 2.东君乳业(禹城)有限公司,山东德州 253000)

传统乳制品来源乳酸菌的发酵特性及其在酸奶中的应用

曹永强1,2,张 健1,余志坚2,陈 超2,周 梅2,宗艳丽2,杨贞耐1,2,*

(1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,食品质量与安全北京实验室,北京工商大学,北京 100048; 2.东君乳业(禹城)有限公司,山东德州 253000)

对从传统乳制品中分离出的4株保加利亚乳杆菌和4株嗜热链球菌发酵特性及应用进行研究。利用脱脂乳进行培养,以发酵时间、风味物质及贮藏过程中的pH、滴定酸度、持水力、粘度变化为指标,研究单菌株的发酵性能。进一步对较优发酵性能菌株复配,考察不同接种比例时酸奶的酸度、粘度、风味、感官等指标,研究其在酸奶中的应用。结果表明,保加利亚乳杆菌Lb.YNF-5和嗜热链球菌St.GST-6具有良好的发酵性能。通过对此两株菌进一步复配,最终确定当保加利亚乳杆菌(Lb.YNF-5):嗜热链球菌(St.GST-6)配比为1∶1时,酸奶产品品质最佳,发酵时间为5.8 h,粘度为7186.47 mPa·s,感官评价得分为76分。本研究综合表明,菌株Lb.YNF-5和 St.GST-6具有开发优良酸奶发酵剂的潜在价值。

保加利亚乳杆菌,嗜热链球菌,风味,发酵性能,筛选

近年来,酸奶由于其独特的风味,丰富的营养价值和良好的保健功能,日益受到消费者的青睐。为保证酸奶稳定良好的品质与口感,工业生产中通常采用直投式发酵剂。然而,我国乳品工业起步较晚,直投式酸奶发酵剂生产技术受乳业强国垄断,需大量依靠进口,严重制约了我国酸奶产业的发展。因此,开发具有自主知识产权的直投式酸奶发酵剂势在必行。开发直投式酸奶发酵剂的基础是筛选具有优良发酵性能的乳酸菌,即优良酸奶发酵菌株—嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌[1]。

一般来说,嗜热链球菌在酸奶发酵前期时表现出较好的产酸特性(主要是分解乳糖生成乳酸),尤其是发酵性能良好的菌株可促进酸奶快速发酵、提高生产效率,改善酸奶风味[2]。有些嗜热链球菌在发酵过程中可产生胞外多糖,可改善酸奶的质构与流变学特性,提高酸奶稳定性和持水性[3]。保加利亚乳杆菌具有较强的产酸性能和耐酸特性,是酸奶后熟过程中的优势菌群,也是导致酸奶发生后酸化的主要菌株。同时,该菌株在发酵过程中能够产生特殊的风味物质如乙醛、丙酮、双乙酰等[4]。通常将发酵性能良好的保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌优化组合用于酸奶加工中达到最佳发酵效果。

传统自然发酵乳制品中蕴含着丰富的乳酸菌。乌仁图雅等[4]从传统乳制品中筛选出菌株具有良好发酵性能的乳酸菌。酸奶的风味是筛选优良菌株时需要考察的重要指标[5]。通常以乙醛和双乙酰作为筛选的主要风味成分[6]。本研究对分离自传统乳制品的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌菌株,通过测定其在酸奶发酵过程中的各项发酵性能指标(产酸、产粘、产香等),筛选出具有良好发酵特性、弱后酸化菌株。同时,对不同比例菌种复配发酵酸奶进行研究,以期为直投式酸奶发酵剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

保加利亚乳杆菌(Lb.YNF-5、Lb.6047、Lb.QH35-3-2、Lb.QH35-2-2),嗜热链球菌(St.GST-6、St.DRC、St.XIRU、St.9y)均分离自奶豆腐等传统乳制品,其中保加利亚乳杆菌为内蒙古农业大学提供,其他菌株保存于本课题组实验室。

蔗糖,氢氧化钠,三氯乙酸,酚酞,浓盐酸,双乙酰标品均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司;脱脂乳粉食品级 新西兰恒天然乳品有限公司。

MRS培养基与M17培养基的配制方法参考王辑等[7]的方法。

脱脂乳培养基:去离子水1 L,蔗糖65 g,脱脂乳粉110 g,搅拌均匀后置于95 ℃灭菌15 min。

1.2 实验仪器

CR21GⅢ立式高速冷冻离心机 日本HITACHI公司;MLS-3750高压蒸汽灭菌器 日本三洋公司;U3900紫外分光光度计 日本HITACHI公司;S20数显pH计 梅特利-托利多仪器有限公司;DV-III Ultra粘度计 美国Brookfield公司;THZ-D电热恒温培养箱 上海一恒仪器科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验设计 单菌株脱脂乳发酵,测定发酵时间,终止pH,滴定酸度,平均产酸速率及粘度,继而考察初筛菌株发酵乳在4 ℃冷藏过程中第18、32、72 h、7、14、21 d时的酸度、粘度、持水力、双乙酰、乙醛的变化,最终筛选出一株发酵性能良好的保加利亚乳杆菌和一株嗜热链球菌。保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌按照不同的比例复配发酵酸奶,pH达到4.5时结束发酵。测定不同配比时的发酵时间、粘度、双乙酰、乙醛、感官鉴定等指标,确定最佳配比。

1.3.2 发酵乳的制备 菌株分别经MRS培养基(应用于杆菌)和M17培养基(应用于球菌)活化两代后接种于脱脂乳培养基中,平板涂布法计数,然后按照1×107CFU/mL的接种量转接到经巴氏杀菌的脱脂乳培养基中,置于42 ℃发酵至终pH降为4.5左右,终止发酵,4 ℃冷藏。

1.3.3 酸奶的制备 将筛选的发酵性能良好的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按照3∶1,2∶1,1∶1,1∶2,1∶3的比例分别接种到灭菌的脱脂乳培养基中,接种量为1×107CFU/mL,发酵至终pH降至4.5,4 ℃冷藏,隔天检测。

1.4 指标的检测方法

1.4.1 酸度的测定 通过pH计直接测定pH,滴定酸度的测定参考GB 5413.34-2010方法。

1.4.2 粘度的测定 采用超声波粘度计测定,检测条件为:LV34转子,转速5 r/min,采样点间隔5 s,扫描时间2 min。

1.4.3 持水力的测定 准确称取5.0 g样品,4 ℃下3000 r/min离心30 min,去上清液,准确称量沉淀物的质量,计算公式为:

式中:m1表示上层清液重量,g,m表示总重量,g。

1.4.4 双乙酰含量的测定 参考李妍等[8]的研究方法。

1.4.5 乙醛含量测定 准确称取样品5.0 g,加入0.5 mL 20%(w/w)柠檬酸与10 mL去离子水,摇匀,室温静置10 min,4000 r/min,4 ℃离心10 min,取上清液过0.45 μm滤膜,密封保存。乙醛含量的测定参照K-ACHYD乙醛测定试剂盒说明书。

1.4.6 风味测定 6名感官鉴定员经专业感官分析培训后分别对酸奶样品的酸甜比、粘度、稠度、口感、风味和质地等指标进行评分[9],评分标准如表1所示。

表1 酸奶感官评价表Table 1 Standards for sensory evaluation of yoghurt quality

表2 发酵乳感官评价表Table 2 Result for sensory evaluation of fermented milk

1.5 数据统计

实验数据采用三平行实验取平均值,通过SPSS数据分析软件处理方差,当p<0.05时差异显著,当p>0.05时,差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同菌株发酵乳发酵时间及产酸速率

Oliveira等研究认为,产酸速率、发酵时间、产酸量是研究乳酸菌产酸特性的重要指标[10-11]。不同保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵乳发酵至终点(pH为4.5时)的时间及平均产酸速率如表2所示,从表2中可以看出,保加利亚乳杆菌的发酵时间在5～12 h之间,其中Lb.YNF-5、Lb.6047发酵时间分别为5.8 h和6.0 h,发酵时间较短,且其平均产酸速率分别为13.08、10.04 °T/h,高于另外两株保加利亚乳杆菌。四株嗜热链球菌的发酵时间在7～24 h之间,其中发酵时间较短产酸速率较高的两株菌分别为St.GST-6(7 h,9.57 °T/h)、St.DRC(8.5 h,7.92 °T/h),根据上述初筛,对于发酵性能良好的菌株Lb.YNF-5、Lb.6047、St.GST-6和St.DRC,用于以下进一步测定其发酵乳冷藏过程中主要特性的变化。

2.2 发酵乳冷藏过程中主要指标的变化

发酵性能优良的乳酸菌不仅需要具备良好的前期发酵性能,还需在发酵乳冷藏阶段保持较好的稳定性及弱后酸化。对于初步筛选得到的发酵性能良好的两株保加利亚乳杆菌和两株嗜热链球菌发酵乳在4 ℃冷藏过程中酸度、持水力、粘度、双乙酰含量、乙醛含量的变化需要进一步测定。

2.2.1 冷藏过程中酸度变化 图1和图2是初筛的保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌发酵乳在4 ℃冷藏21 d过程中pH及滴定酸度的变化情况。从图1可以看出,随着冷藏时间的延长,保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的pH总体上呈现先稳定后下降的趋势。Lb.YNF-5和Lb.6047在0～72 h时,pH变化不显著,在第72 h时,其pH分别为4.51(Lb.YNF-5)、4.52(Lb.6047)。在第72 h～21 d过程中,Lb.YNF-5和Lb.6047的pH下降趋势相同,但在这一过程中,Lb.YNF-5的pH明显高于Lb.6047的pH。从图2看出,Lb.YNF-5与Lb.6047的滴定酸度与pH的变化相反,随着贮藏时间的延长,滴定酸度呈现上升的趋势,Lb. YNF-5,Lb.6047的滴定酸度分别从冷藏初期的75.22 °T和67.65 °T上升到84.24 °T和85.52 °T,介于GB 5413.34-2010要求的70～110 °T之间,这说明这两株保加利亚乳杆菌属于弱后酸化菌株,适宜酸奶生产。

图1 不同菌株发酵乳在4 ℃冷藏21 d期间pH的变化Fig.1 Changes in pH of ferment milk during storage at 4℃ for 21 d

图2 不同菌株发酵乳在4 ℃冷藏21 d期间滴定酸度的变化Fig.2 Changes in titratable acidity of ferment milk during storage at 4 ℃for 21 d

嗜热链球菌St.GST-6与St.DRC在0～72 h冷藏过程中,pH的变化幅度较小,72 h后pH开始下降,至21 d时,此两株菌的pH分别降为4.25和4.31。研究表明,当pH低于5.0时,嗜热链球菌的生长速率就会放缓,这也是在酸奶发酵过程中,前期由嗜热链球菌主导而后期由保加利亚乳杆菌主导的原因[12]。从图2还可以看出,St.GST-6与St.DRC在冷藏过程中的滴定酸度也呈现上升的趋势,在第21 d时,滴定酸度分别为83.28 °T(St.GST-6)、79.50 °T(St.DRC)均符合GB 5413.34-2010标准。综上,Lb.YNF-5与Lb.6047,St.GST-6与St.DRC在后发酵过程中的酸度变化都不大,属于弱后酸化菌株,满足酸奶发酵对于酸度的要求。

2.2.2 冷藏过程中持水力的变化 持水力是考察酸奶在冷藏过程中稳定性的重要指标,不同菌株在4 ℃冷藏21 d过程中的持水力变化情况如图3所示。从图3可以看出,4株菌的发酵乳在冷藏初期(36 h)的持水力皆维持在32%左右,在冷藏过程中,持水力均呈现先增后降的趋势。其中,嗜热链球菌发酵乳的持水力要高于保加利亚乳杆菌发酵乳的持水力,这可能是由于其在发酵过程胞外多糖的产量较高,使其拦截水的能力有所提高,从而增加了其持水力造成的[13]。两株嗜热链球菌在冷藏7 d过程中,变化趋势相同,在第7～14 d时,St.GST-6发酵乳的持水力变化不显著,维持在38%左右,而St.DRC发酵乳的持水力发生了显著下降,从38%降为32%。在第14～21 d时,两株菌发酵乳的持水力均出现显著下降,最终分别降为29.79%和28.92%,因此,贮藏期间St.GST-6表现出较好的持水力。两株保加利亚乳杆菌在冷藏的前72 h内即出现了显著的变化,菌株Lb.YNF-5的持水力从18 h的31.62%,增加到了72 h时的37.35%。而菌株Lb.6047在此期间变化并不显著,维持在32%左右。冷藏72 h后,两株菌的持水性随着冷藏时间的延长显著下降,在第21 d时,两菌的持水力分别降为25.08%和25.10%,Lb.YNF-5的持水力表现良好。

图3 冷藏过程中持水力的变化Fig.3 Changes of water holding capacity during cold storage for 21 d

2.2.3 发酵乳冷藏过程中粘度的变化 粘度是评价发酵乳口感与质构的重要指标,图4描述了4株菌在冷藏过程中的粘度变化。从图4中可以看出嗜热链球菌的粘度均高于保加利亚乳杆菌,一方面,这可能是由于其发酵过程中产胞外多糖,提高了发酵乳结构的稳定性[14],另一方面,保加利亚乳杆菌是后发酵过程中的优势菌,在低温冷藏过程中不断发酵产酸,对酸奶的质构产生影响,从而导致其粘度普遍低于嗜热链球菌[15]。对于嗜热链球菌来说,St.GST-6发酵乳的粘度优于St.DRC,酸奶生产中粘度越高,菌种的品质越好,因此St.GST-6更适宜酸奶发酵。比较两株保加利亚乳杆菌,Lb.YNF-5发酵乳在冷藏过程中粘度较Lb.6047稳定,随着冷藏时间的延长,其粘度并未出现严重的下降,这表明其后酸化能力较弱,适宜酸奶生产。

图4 冷藏过程中粘度的变化Fig.4 Changes of viscosity during cold storage for 21 d

2.2.4 发酵乳冷藏过程中双乙酰含量的变化 双乙酰在酸奶发酵过程中产量较小,但因其阈值较大,是酸奶形成奶油香味的重要风味物质。图5测定了4株菌在冷藏过程中双乙酰的含量。从图5可以看出,随着冷藏时间的延长,不同菌株发酵乳的双乙酰含量存在一定差异,其中嗜热链球菌St.GST-6双乙酰含量明显高于St.DRC的量,且在冷藏过程中呈现先增加后降低的趋势,在贮藏的第14 d时达到峰值,21 d时可能是由于贮藏末期pH降低导致的[16]。康欢[17]等研究发现,当酸奶产品中双乙酰的含量超过2 μg/mL时可表现出良好的奶油香味,因此St.GST-6与St.DRC都能够满足酸奶生产的需要,但是St.GST-6含量较高,效果更佳。保加利亚乳杆菌Lb.YNF-5和Lb.6047在贮藏过程中也呈现先增后降的趋势,然而这种变化趋势不太显著,表明此两株菌在冷藏过程中双乙酰含量较为稳定。

图5 冷藏过程中双乙酰含量的变化Fig.5 The diacetyl content of strains during cold storage

2.2.5 发酵乳冷藏过程中乙醛含量的变化 乙醛是构成酸奶风味的主要物质之一,酸奶中乙醛含量过高或者过低都会导致酸奶风味不佳,刘宁宁等[6]研究报道乙醛在酸奶中起作用的最低阈值为5 μg/mL,而超过30 μg/mL时,发酵乳就会产生不良风味。图6是4株菌在冷藏过程中乙醛含量的变化情况,从图6可以看出,在冷藏期间,虽然随着时间的延长,酸奶中乙醛的量会发生先增加后降低的显著变化,但是保加利亚乳杆菌发酵乳的乙醛产量明显高于嗜热链球菌发酵乳,这表明酸奶中主要是由保加利亚乳杆菌产生乙醛的。Handan[4,18]等研究发现,酸奶中的乙醛含量介于5～21 μg/mL时,酸奶可以呈现较为典型的酸奶风味,四株菌的发酵乳中只有St.DRC的在冷藏第7 d后乙醛含量低于5 μg/mL,而其余三株菌的乙醛含量一直维持在5 μg/mL以上。因此Lb.YNF-5、Lb.6047和St.GST-6均适宜酸奶生产对乙醛含量的需要,其中Lb.YNF-5的乙醛产量及贮藏过程中的稳定性高。

表3 不同菌种配比时酸奶指标Table 3 Index of yogurt at different of strain ratios

注:同列肩标小写字母不同表示差异显著(p<0.05)。

图6 冷藏过程中乙醛含量的变化Fig.6 The acetaldehyde content of strains during cold storage

2.3 优良发酵性能保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌复配

2.3.1 优良发酵性能 综上对不同菌株发酵与冷藏特性的研究,筛选出St.GST-6和Lb.YNF-5作为最优酸奶发酵剂菌株。将此两株菌以不同配比发酵酸奶,结果如表3所示。从表3可以看出,当达到发酵终点即pH降至4.5时,球菌占优势的配比的发酵时间要短于杆菌占优势的配比,这与秦南兵等[19]的研究一致。此外,不同比例的球菌杆菌配比也会影响酸奶的理化指标,发酵结束后,不同菌种配比的酸奶理化指标之间存在显著性差异,配比St./Lb.为3∶1时酸奶的粘度最高,为8374.21 mPa·s,随着球菌比例的降低粘度不断下降,这可能是由于St.GST-6高产胞外多糖导致的,李志成等[20]在研究保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的产粘特性时也有类似发现。表中还可看出,当酸奶中杆菌占优势时,双乙酰的含量高于球菌占优势时的含量,而乙醛含量变化没有明显规律,这可能是球菌与杆菌在发酵过程中的共生作用造成的。

2.3.2 不同菌种配比感官评价 根据感官评价表要求,对不同菌种配比酸奶的酸甜比、粘度、稠度、口感、风味和质地进行感官鉴定,结果如表4所示。从表4可以看出,配比St./Lb.为1∶1时,感官评价的总分最高为76分,此配比下酸奶的口感得分明显高于其他配比组。相应的,酸奶的风味得分也是配比St./Lb.为1∶1最高。虽然对不同配比时酸奶的主要风味物质进行量化时,配比St./Lb.为1∶1的双乙酰、乙醛含量不是最高的,但是风味得分较高,这可能是由于其双乙酰和乙醛的比例适中从而导致整体风味良好。综上分析,St.GST-6和Lb.YNF-5的最佳感官配比为1∶1。

表4 不同菌种比例酸奶感官鉴定得分Table 4 Evaluation score of yogurt at different ratio of strain ratio

3 结论

本研究通过对源自传统乳制品的嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的发酵特性及贮藏特性进行研究,筛选出一株发酵性能良好的嗜热链球菌St.GST-6和一株保加利亚乳杆菌Lb.YNF-5,并且对此两株菌以不同比例复配发酵酸奶,确定最佳发酵比例为1∶1。实验中,虽然此菌株配比的酸奶的发酵时间5.8 h不是最短,终止酸度89.55 °T,粘度7186.47 mPa·s,双乙酰含量5.41 μg/mL,乙醛含量8.74 μg/mL不是最大值,但是,两株菌合理的搭配可以形成酸奶良好的口感与风味,感官评价得分为76分是最高得分。筛选出的嗜热链球菌St.GST-6和保加利亚乳杆菌Lb.YNF-5发酵时间短,后酸化较弱,按照合理配比制作的酸奶口感适中,具有开发商业发酵剂的潜力。

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Fermentation properties ofLacticacidbacteriafrom traditional dairy products and application in yogurt

CAO Yong-qiang1,2,ZHANG Jian1,YU Zhi-jian2,CHEN Chao2, ZHOU Mei2,ZONG Yan-li2,YANG Zhen-nai1,2,*

(1.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nurtrition and Human Health, Beijing Labaratory for Food Quality and Safety,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China; 2.Dongjun(Yucheng)Dairy Co.,Ltd,Dezhou 253000,China)

In this study,four strains ofL.bulgaricusand four strains ofS.thermophilus,which were isolated from traditional dairy products,were investigated for the fermentation parameters and application in yogurt. Strains were fermented by skim milk culture medium. Fermentation properties such as fermentation time,main flavor substance,pH,titration acidity,viscosity and water holding capacity were determined. Strains with superior fermentation performance were further fermented with different ratios.Fermentation parameters and sensory parameters of the fermented milk were assayed. The results showed that Lb.YNF-5 and St.GST-6 were selected as the strains with superior fermentation performance. The best ratio was Lb.YNF-5∶St. GST-6=1∶1,giving the best quality of yogurt with fermentation time of 5.8 h,viscosity of 7186.47 mPa·s,the sensory evaluation score of 76 points. In summary,Lb.YNF-5 and St.GST-6 could be good candidates potential of application as yoghurt starter cultures.

Lactobacillusbulgaricus;Streptococcusthermophilus;flavor;fermentation properties

2016-10-19

曹永强(1991-)，男，硕士，研究方向：乳品生物技术，E-mail:caoyongqiang91@163.com。

*通讯作者:杨贞耐(1965-)，男，博士，教授，研究方向：乳品加工及交叉学科的理论和应用，E-mail:yangzhennai@th.btbu.edu.cn。

国家自然科学基金面上项目(31371804)；公益性行业(农业)科研专项(201303085)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)07-0145-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.020