复方三七消痛软膏超声导入对兔膝骨性关节炎治疗作用及机制研究❋

何 坚，梁 杰，罗庆禄△，柳维林，林如辉，5

(1.福建中医药大学康复医学院，福州 350122;2.福建省运动功能康复重点实验室，福州 350003;3.福建中医药大学附属康复医院，福州 350003;4.福州市第二医院康复科，福州 350007;5.福建中医药大学中西医结合研究院，福州 350122)

复方三七消痛软膏超声导入对兔膝骨性关节炎治疗作用及机制研究❋

何 坚1，2，3，梁 杰4，罗庆禄1，2，3△，柳维林1，2，林如辉4，5

(1.福建中医药大学康复医学院，福州 350122;2.福建省运动功能康复重点实验室，福州 350003;3.福建中医药大学附属康复医院，福州 350003;4.福州市第二医院康复科，福州 350007;5.福建中医药大学中西医结合研究院，福州 350122)

目的:探讨复方三七消痛软膏用超声波(US)导入对兔KOA疗效及其作用机制。方法:将4月龄新西兰大白兔40只按随机数字表法分为复方三七消痛软膏超声波导入组(A组)、普通US组(B组)、舒筋止痛水外擦组(C组)、假US组(D组)和正常对照组(E组)各8只，除E组外各组动物均行双侧前交叉韧带离断术造模。6周后A、B、C、D组分别给予复方三七消痛软膏超声波导入普通US、假US、舒筋止痛水外擦干预10 d，E组不给予任何干预。干预后软骨切片HE染色光镜观察形态结构及Mankin评分;采用TUNEL法检测软骨细胞凋亡阳性比率;采用TUNEL法检测软骨细胞凋亡阳性率，Western－blot技术检测软骨细胞caspase－9、caspase－3蛋白水平表达。结果:A组关节软骨病变明显轻于B、C、D组但较E组严重;A组Mankin评分低于B、C、D组、高于E组，差异有统计学意义。干预后A组软骨细胞凋亡阳性率以及caspase－9和caspase－3蛋白表达均低于B、C、D组，高于E组，差异有统计学意义。结论:复方三七消痛软膏超声波导入能更好地延缓KOA软骨退变，其机制可能是通过抑制caspase－9和caspase－3表达从而抑制软骨细胞凋亡实现。

骨性关节炎;超声波;药物导入;软骨;caspase

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种以关节软骨退变为主要病理特征的常见骨关节疾病，虽然其治疗方法颇多，但不少方法(如口服氨基糖甙类药物、注射透明质酸钠、针灸、推拿)均缺乏循证医学证据。虽然非甾体类药物治疗OA的应用具有A级证据，但其无法改变或延缓其软骨病理改变。国内外研究证实，口服或外用中药和超声波(Ultrasound，US)治疗KOA均有较好疗效且均无明显副作用特点［1－2］。国内外有报道［3－4］，用US导入中药或西药较之单纯US治疗KOA更有效，且可避免口服药物依从性差的问题。我院院内制剂舒筋止痛水外擦结合拍打或相同药物制成的复方三七消痛软膏外擦，在治疗不同部位OA方面均有良好的临床效果。笔者研究发现，舒筋活血止痛水外擦拍打能降低兔KOA软骨组织MMP－1表达［5］，但其具体机制还不十分明确。现代研究表明，OA的发生发展与关节软骨细胞凋亡密切相关，而caspase－9和caspase－3分别是细胞凋亡早期和后期的信号分子。因此，我们研究复方三七消痛软膏US导入对兔KOA软骨形态、软骨细胞凋亡阳性表达和凋亡基因caspase－9、caspase－3蛋白含量测定的影响，明确复方三七消痛软膏US导入治疗KOA的更优疗效并探讨其可能的分子细胞学机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康普通级4月龄新西兰大白兔40只(雌雄各半)，体质量(2.5±0.5)kg，由福建中医药大学动物实验中心饲养(合格证号SCXK(上海)20120011)。

1.1.2 实验主要试剂 蛋白裂解液(碧云天P0013B)、BCA试剂盒(Thermo，MK164229)、分离胶(碧云天 P0012A)、转移缓冲液(碧云天PA196400)、TUNEL检测试剂盒(美国罗氏公司TUN11684817)、10%脱脂奶粉(BBI life science，B805BA0003)、PBST(上海樊克生物生物科技有限公司FK－RS2426)、Caspase－9和Caspase－3单克隆抗体(一抗，上海容创生物技术有限公司RCL0245)各若干瓶、辣根酶系列二抗(上海容创生物技术有限公司RCL0248)、显影液(碧云天P0018);复方三七消痛软膏(批件号闽2012S0002，批准文号闽制药Z20120002，由福建中医药大学附属第二人民医院提供);无水乙醇(西陇化工股份有限公司，15031402)，苏木素、伊红染液(索莱宝20150407);防脱载玻片(江苏世泰实验器材有限公司16020)，包埋机(孝感市亚光医用电子技术有限公司20080172)，莱卡切片机(德国徕卡仪器有限公司20130215)，烤片机 (上海跃进医疗器械厂20121953)，电子显微镜(德国徕卡仪器有限公司20130216)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 根据SPSS13.0统计软件编程并按随机数字表法将40只新西兰大白兔分为复方三七消痛软膏US导入组(A组)、普通US组(B 组)、舒筋止痛水外擦组(C组)、假US组(D组)和正常对照组(E组)5组各8只。

1.2.2 兔KOA模型建立 各组动物在同等条件下饲养，饲养1周后除E组外均行右侧ACTL切断术。手术参照Batist等［6］报道手术方法。术后不固定，允许笼内自由活动。并按每天15 mg/kg的剂量肌注庆大霉素(80 mg/2 ml)预防感染，连用5 d。术后分笼饲养，基础饲料为标准颗粒，由福建中医药大学实验动物中心提供，所有工作均在遵循中华人民共和国实验动物道德委员会关于动物保护和相关法规的指导方针下进行。

1.2.3 干预方法 造模6周后，A、B、C、D 4组兔分别固定于兔手术台，脱去双侧膝关节处毛。其中A、B、D 3组兔采用同一型号(日本伊藤公司生产的us－700型)、同一参数(强度300 mW/cm2、通断比为20%、频率为3 MHz;声头直径1 cm;每次10 min，每天1次，连续5 d为1个疗程，停2 d再行下1个疗程，共2个疗程)的US仪，经水囊接触法，分别导入复方三七消痛软膏、普通耦合剂和普通耦合剂假US(只移动声头，不开启强度开关干预)。C组去除双膝关节周围毛发，均匀涂上舒筋活血止痛水外擦剂，在膝关节周围用食指、中指和环指第二指节掌面轻微拍打涂有舒筋活血止痛水处，以使药水充分吸收，但不使动物有惊恐感为度，治疗参数同A、B、D组，E组按正常饲养，不给予任何干预。

1.3 干预后软骨形态学、软骨细胞凋亡及凋亡基因Caspase蛋白表达检测

1.3.1 干预后软骨形态光镜观察及HE染色Mankin评分 干预结束后空气栓塞法处死，将双侧膝关节分离，用咬骨钳离断股骨髁，用40 g/L中性甲醛缓冲液固定1～2 d，脱钙、修块、系列乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋及修块。切片、裱片、烤片后，对股骨内侧髁进行纵切，切片厚度为5 μm，用于形态学观察。苏木精－伊红染色(HE染色)，光学显微镜观察，按改良Mankin［7］进行评分:正常关节软骨标本(0分):表层光滑、平整，软骨细胞分布均匀，无簇聚软骨细胞，潮线完整，染色均匀，无失染现象;轻度骨关节炎标本(2～7分):表层略不平整，有小裂隙，中深层有少量簇聚的软骨细胞和单个肥大软骨细胞，某些标本潮线断裂或出现双重潮线，染色有失染现象;中度骨关节炎标本(8～12分):表层不平整，有裂隙深达中、深层，部分标本表层或中层有原纤维变，中、深层细胞排列紊乱，有大量簇聚软骨细胞，潮线断裂或出现双重潮线，染色不均匀，表层和中、深层有失染现象;重度骨关节炎标本(13～14分)表层变薄有深至软骨下骨的裂隙，细胞排列紊乱，有大量簇聚软骨细胞，潮线消失，染色不均匀，全层有明显失染。

1.3.2 干预后软骨细胞凋亡阳性表达检测同HE染色法制取软骨标本切片，采用TUNEL免疫荧光法测定软骨细胞凋亡细胞阳性表达。按说明书操作检测软骨细胞凋亡率，石蜡包埋切片干燥后脱蜡固定;室温下无水乙醇洗涤，依次用梯度乙醇水化，85%NaCl洗涤，PBS洗涤1次;4%多聚甲醛固定，PBS洗涤2次，滴加100 μl新鲜配制的蛋白酶K溶液，孵育10 min;PBS液清洗，用4%多聚甲醛固定，用PBS洗涤1次;滴加100 μl平衡溶液平衡10 min，避光冰水上制备rTdT孵育缓冲液;滴加上述配制的rTdT孵育缓冲液并覆盖组织块;37℃孵育箱中孵育60 min，蒸馏水稀释，将玻片浸泡于Coptin管中，15 min后终止反应，用PBS洗涤，滴加1 μg/ml 的PI，避光染色15 min;PBS洗涤，梯度酒精脱水，荧光显微镜观察下结果。暗室内荧光显微镜在波长520 nm下观察荧光素的绿色荧光，在波长620 nm条件下观察PI的红色荧光，迭加后红色背景下的显示黄色、淡黄色、黄绿色、绿色细胞即为凋亡的软骨细胞。荧光显微镜观察下结果，暗室内荧光显微镜在波长520 nm下观察荧光素的绿色荧光，在波长620 nm条件下观察PI的红色荧光，迭加后红色背景下的显示黄色、淡黄色、黄绿色、绿色细胞即为凋亡的软骨细胞。统计3个视野下细胞凋亡率(凋亡细胞数/软骨细胞总数)，即凋亡指数(apoptosis index，AI)。

1.3.3 干预后软骨细胞Caspase－9、Caspase－3蛋白表达检测 手术刀切取双侧胫骨平台全层软骨，生理盐水冲洗，置管于－70℃液氮罐中保存，用Western－blot方法测定Caspase蛋白表达。将组织放入碾钵中加入液氮进行碾磨，直至成为细小粉末为止，将粉末收集在一定量的蛋白裂解液中(裂解液以1∶5的体积比混合，冰上匀浆;加入300 μl的蛋白裂解液提取总蛋白，加变性缓冲液煮沸10 min变性。SDS－PAGE凝胶电泳，200 mA湿转2 h。5%脱脂奶粉室温封闭膜2 h，分别用caspase－9和caspase－3一抗(1∶100)4℃孵育过夜，TBS漂洗，ECL光化学法显色。内参GADPH蛋白测定显示，除一抗为抗GADPH抗体外，余步骤同前，并使用凝胶成像分析系统扫描结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量资料Mankin评分、Caspase蛋白表达值以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，多重比较用SNK－q检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干预后各组软骨形态学比较

图1显示，HE染色观察比较，A组软骨轻度变性，软骨表层结构稍疏松，细胞外基质轻度降解;B组和C组软骨中度变性，细胞外基质轻度降解，表面欠光滑;D组软骨重度变性，软骨细胞出现集簇现象，软骨表面粗糙，细胞外基质重度降解，关节软骨裂隙增大;E组形态学表层细胞数稍减少，但软骨细胞排列基本整齐，无明显软骨基质降解。表1显示，Mankin评分比较，A、B、C、D组均著高于E组(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C组均显著低于D组(P＜0.05或P＜0.01)，A组显著低于 B、C2组(P＜0.051)。

图1 干预10 d后各组股骨髁软骨切片HE染色观察比较(×400倍)

表1 干预后股骨髁软骨切片HE染色光镜观察Mankin评分比较(±s)

表1 干预后股骨髁软骨切片HE染色光镜观察Mankin评分比较(±s)

注:与正常组比较:*P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.01或 P＜0.05;与单纯超声组药物拍打组比较:★P＜0.05

组别 Mankin 分值A组 3.88±1.25*#★1.37±0.52 B组 4.45±1.28*#C组 5.37±1.60*#D组 6.75±2.25*E组

2.2 干预后各组软骨细胞凋亡阳性率表达结果比较

表2图2显示，软骨细胞凋亡率A、B、C、D组均显著高于E组(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C组均显著低于D组(P＜0.05或P＜0.01)，A组显著低于B、C2组(P＜0.05)。Caspase－3蛋白表达A、B、C、D组均著高于E组(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C组均显著低于D组(P＜0.05)，A组显著低于B、C2组(P＜0.05)。

2.3 干预后Western－blot检测各组软骨细胞凋亡基因caspase－9、caspase－3蛋白表达结果比较

表2图2显示，Caspase－9蛋白表达A、B、C、D组均著高于E组(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C组均显著低于D组(P＜0.05或P＜0.01)，A组显著低于B、C2组(P＜0.05)。Caspase－3蛋白表达A、B、C、D组均著高于E组(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C组均显著低于D组(P＜0.05)，A组显著低于B、C2组(P＜0.05)显示。

图2 各组软度细胞凋亡阳性表达比较

图3 各组软度细胞caspase-9、caspase-3蛋白含量Western-blot印迹表达比较

表2 各组软骨细胞凋亡率及Caspase-9、Caspase-3蛋白表达值比较(±s)

表2 各组软骨细胞凋亡率及Caspase-9、Caspase-3蛋白表达值比较(±s)

注:与正常组比较:*P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.01或 P＜0.05;与单纯超声组药物拍打组比较:★P＜0.05

3 讨论

KOA的主要病理变化是关节软骨退变、软骨下骨增生，骨赘形成，刺激周边组织引起疼痛。随着时间延长，关节间隙变窄、关节变形，导致关节僵硬、活动度降低影响日常生活。因此，其治疗根本是促进软骨合成和延缓软骨退变。多数KOA患者就诊是因为出现疼痛，虽然目前缓解疼痛的方法颇多，但均存在一定的缺陷。如口服非甾体类药物可能有胃肠道刺激甚至出现消化道出血，且无法改变软骨退变;口服氨基糖甙类药物疗程长、费用高;关节腔注射玻璃酸钠存在可能损伤软骨的风险;口服中药也存在味苦、煎药耗时、疗程长等问题。因此，寻求一种简单、方便、有效的KOA是当务之急。

随着现代康复技术在我国大陆应用的快速发展，不少物理因子可缓解KOA疼痛，但由于作用机制不一，某些物理因子(如湿热敷、红外线)无法作用于关节深层组织，对关节软骨的作用有限。而Korstjens［8］等也发现，低强度脉冲超声波(low intensity pulse US，LIPUS)可促进体外干预软骨细胞增殖以及细胞外基质的合成。高明霞等［9］用LIPUS可以减轻关节软骨ECM的损伤程度，其作用与LIPUS治疗后关节软骨中p38、ERK1/2表达下调有关，并从软骨的合成方面证实US治疗KOA的效果和机制。然而KOA的发生除软骨合成减少外，软骨细胞过度凋亡也是KOA发生发展的重要原因。有研究证实，US较毫米波、超短波、低功率激光、脉冲电磁场能更好地抑制兔KOA模型软骨细胞凋亡，从而延缓软骨细胞退变［10－11］。表1、2、图1、2显示，本次的研究证实，单纯US可以抑制软骨细胞凋亡，延缓软骨退变，临床也证实US治疗能改善KOA患者功能［12］。

表2图3显示，虽然单纯US能较好地缓解KOA疼痛症状且能延缓软骨退变，但一些研究发现，应用US机械振动原理导入一些药物能更好地促进局部药物吸收，起到US和药物的双重效果，且减少口服药物对胃肠道刺激的副作用或单纯局部外用药物吸收率低的问题［3－4］。因此，我们用US导入我院院内制剂复方三七消痛软膏(该方主要由川乌、草乌、红花、当归、川芎等组成，具有祛风除湿、活血化瘀、宣痹止痛、补肾强筋功效，符合KOA发病的中医病因病机)治疗KOA，并与该方的酊剂(舒筋止痛水)外擦和单纯超声波治疗KOA疗效作比较。同时研究其作用机制发现，US导入复方三七软膏在抑制软骨细胞凋亡、延缓软骨退变效果均优于单纯US或其酊剂外擦拍打法。而软骨细胞凋亡信号caspase－9和caspase－3蛋白含量发现，US导入复方三七消痛软膏、单纯US或舒筋止痛水外擦怕打，均能不同程度地降低 caspase－9和 caspase－3蛋白表达，抑制软骨凋亡。有研究发现，复方三七软膏方中的川芎成分川芎嗪能抑制OA软骨细胞caspase－9蛋白表达，以治疗软骨破坏［13］;当归注射液能通过调节与软骨细胞凋亡有关的PI3K/AKT蛋白含量，延缓软骨退变［14］。而本研究证实，由当归、川芎、怀牛膝等组成的复方三七消痛软膏同样能抑制软骨细胞caspase－9和caspase－3表达(表2，图3)。

我们的研究结果显示，US导入复方三七软膏、复方三七软膏外用和单纯US治疗KOA均有一定效果，其机制可能是通过抑制软骨细胞凋亡相关因子caspase－3和caspase－9的蛋白表达来实现的。同时笔者认为，用US导入复方三七软骨治疗KOA具有以下优点:一是能使中药直达关节深部组织，解决口服中药存在对胃肠道刺激且依从性差问题;二是与传统针灸、推拿比较，能够减少治疗时间，US导入治疗一般是5～10 min，后者一般要30～40 min;三是医疗费用低，US导入治疗一般收费40元，而药物、针刺、推拿、关节腔注射收费基本上百元。因此，笔者认为，临床KOA的康复治疗方法，应充分发挥中西医各自的优点或中西医结合优势，我们提倡有条件的医疗单位可使用US治疗KOA;如果能够研制出针对KOA病因病机的中药制剂，结合US导入，效果更明显，值得今后进一步研究应用。

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Study of Therapeutic Effects and Mechanisms of Ultrasound Phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste for Treatment Knee Osteoarthritis in Rabbits

HE Jian2，3，LIANG Jie4，LUO Qing－lu1，2，3△，LIU Wei－lin1，2，LIN Ru－hui4，5
(1．College of rehabilitation medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou Fujian，350122，China; 2．The key laboratory of Motor Function of Fujian，Fuzhou Fujian 350003，China;3．Affiliated Rehabilitation Hospital Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou Fujian 350003，China;4．The second hospital of Fuzhou，Fuzhou，350007，China;5．Fujian Academy of Integrative Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China)

Objective:Observing the theraputic effects and studying the mechanisms of US phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste in KOA rabbits.Methods:Four month old，40 white New Zealand rabbits，were randomly divided into US phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste(A group)，normal US(B group)，ShuJinZhiTong water local external pat(C group)，sham normal US(D group)and nornal controls(E group)groups.All were subjected to double knee anterior cruciate ligament abscise(ACLA)except E group，each group included 8 rabbits.Six weeks after surgery，A，B，C，D group(surgical knee joint)were interrupted with US phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste，normal US，ShuJinZhiTong water local external pat，sham normal US for 8 min per day for 10 days(5 days after exposure，stopping 2 days，continue，exposure 5 days)，respectively.After 10 days intervention，all rabbits were sacrificed by air injection.The cartilaginous tissue was stained with Hematoxylin and Eosin(H＆E)and observed chondrocyte morphology by light microscopy and Mankin’s score were counted.Chondrocytes apoptosis were detected by TUNEL.Incide tibial plate full－thickness cartilage for apotposis gene of caspase－9 and caspase－3，measurement the protein content by Western－Blot in chondrocyte.Results The Mankin scores in A groups was significantly lower than B，C，D groups，and significantly higher than E group.The apoptosis of chondrocytes and the caspase－9，caspase－3 protien expression in A groups were significantly lower than B，C，D groups，and significantly higher than E group.Conclusions US phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste can regress cartilage apomorphosis for treatment OA，and superior to the general US interruption.It downregulated the expression of caspase－9 and caspase－3 protien in chondrocyte，which it may be the theraputic signal molecules.

Osteoarthritis;Ultrasound;Drug phoresis;Chondrocyte;Caspase

R285.5

B

1006－3250(2017)02－0191－05

2016－08－07

国家自然科学基金资助项目(81273774)

何 坚(1970－)，男，副教授，医学硕士，从事骨关节疾病的中医推拿研究。

△通讯作者:罗庆禄(1973－)，男，副教授，医学博士，从事骨关节疾病的现代康复研究，E－mail:luo_qinglu@126.com。