实验用小型猪乙型脑炎病毒的分离鉴定

王 吉，付 瑞，李晓波，王淑菁，巩 薇，卫 礼，岳秉飞，贺争鸣

(中国食品药品检定研究院国家实验动物微生物遗传检测中心，北京 100050)

研究报告

实验用小型猪乙型脑炎病毒的分离鉴定

王 吉，付 瑞，李晓波，王淑菁，巩 薇，卫 礼，岳秉飞*，贺争鸣*

(中国食品药品检定研究院国家实验动物微生物遗传检测中心，北京 100050)

目的 了解小型猪感染乙型脑炎病毒株的特点。方法 猪脑组织经过处理，接种BHK21细胞，进行病毒培养、间接免疫荧光试验、中和试验、电镜观察，及通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增新分离毒株E区段和PrM区段核苷酸序列，测序后进行基因型鉴定。结果 25只猪脑组织接种BHK21细胞，有3个组织处理液能使BHK21细胞发生圆缩、集聚等病变；3个组织接种的BHK21病变细胞滴片进行免疫荧光试验，均产生强绿色荧光反应；中和实验结果显示3株新分离株中和效价均为1∶64；电镜下可见直径40nm左右球型病毒粒子；RT-PCR产物测序结果与疫苗株E区段核苷酸比较同源性均为95%；3株新分离株均为GIII型乙脑病毒。结论 实验表明小型猪场存在乙型脑炎病毒感染，为GIII型乙型脑炎病毒。

乙型脑炎病毒；分离；鉴定

流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)成员，乙型脑炎病毒基因为单股正链RNA，病毒颗粒呈球形，有包膜，直径40～ 60nm，病毒粒子呈20面体对称[1-4]。由乙型脑炎病毒引起的流行性脑炎简称乙脑，乙脑是一种人畜共患的自然疫源性疾病，是以中枢神经系统损害为主的急性传染病，带毒猪是本病的主要传染源[4，5]。因此防治乙脑不仅可以减少养猪业的损失，并通过猪的免疫预防，可控制本病在猪及人群中的流行。

我国于1949年在北京首次分离到乙脑病毒，随后在其他地区也相继分离到该病毒[6]。乙脑主要流行于亚洲国家及地区，近年来流行区域不断扩大，已经扩展到澳大利亚，韩国、泰国、印度尼西亚的爪哇、俄罗斯西伯利亚的滨海地区等相继有乙脑的报道。我国除新疆、西藏、青海省外，其余各省均有发病流行，是严重危害公众健康的重要传染病，乙脑已成为世界关注的公共卫生问题之一[1，6-9]。国内外对JEV的研究较多，在我国也从多个省份通过不同途径分离得到JEV，但从猪脑中分离到JEV的报道还不多[5]，尤其是从小型猪脑中分离JEV目前还没有报道。为了解北京小型猪感染JEV的特征，加强小型猪的免疫预防，本研究从北京市某小型猪场的3头猪脑组织中分离到的3株乙型脑炎病毒，并进行形态学、血清学和分子生物学鉴定，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料

DMEM培养基：HyClone公司产品；胎牛血清：杭州四季青公司产品；免疫荧光素(山羊抗猪IgG-FITC)：KPL公司产品；猪抗JEV血清及猪阴性血清：中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室提供；细胞固定液：中国农业大学生命科学研究中心电镜室提供；乳仓鼠肾细胞(Baby Hamster Syrian Kidney， BHK21)。BHK21细胞：本室冻存； JEV毒株(Nakayama-NIH)、兔抗JEV标准阳性对照血清：由本院病毒一室提供；25只猪脑组织：北京某小型猪场提供的-70℃冻存脑组织；RNA快速提取试剂盒：购自德国Qiagen公司；Taq HS酶、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)、10×PCR buffer、100bp DNA marker：均购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR仪：美国Bio-Rad公司MYCYCLER；核酸琼脂糖凝胶电泳仪：美国Bio-Rad公司PwerPac Basic；凝胶成像分析仪：美国 Kodak公司 GL212Pro； DNA序列分析软件：DNA Star MegAlign软件。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分离

取的25个冻存的猪脑组织(编号为1～25)，无菌条件下用PBS研磨，经1000 r/min离心10 min，除菌过滤。

将样品处理液接种长满单层的BHK21细胞，置于37℃体积分数5%CO2培养箱中培养，每天观察细胞病变，并记录结果。每隔2～3 d换液1次，10 d后如出现致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)则进行盲传，盲传至3代仍无CPE出现，则视为分离阴性。出现CPE的细胞，待CPE达到80%～ 90%收冻。冻融3次后继续传代，传至3代，仍有CPE出现，则视为分离阳性[10-12]。

1.2.2 免疫荧光试验

将连续传至第3代的细胞滴片，与1∶10稀释的猪JEV阴性血清和猪JEV阳性血清进行免疫荧光试验。同时设正常BHK21细胞片和JEV感染BHK21细胞片作为阴性抗原片和阳性抗原片对照。在阴性抗原对照和阳性抗原对照成立的条件下，样品片与JEV阴性血清和JEV阳性血清均无绿色荧光反应，该样品判为JEV阴性；样品片与JEV阴性血清无绿色荧光反应，与JEV阳性血清有绿色荧光反应，该样品判为JEV阳性。

1.2.3 中和试验

用兔抗JEV标准阳性血清和细胞维持液分别与JEV细胞毒(JEV感染BHK21细胞毒)、与经细胞试验和免疫荧光试验检测JEV阳性的3只猪脑组织接种的P5代BHK21细胞毒，以1∶2～1∶512混合，37℃作用30 min后，接种BHK21细胞。同时设JEV标准毒株对照和正常BHK21对照，每天观察细胞病变，连续观察7d并记录结果。

1.2.4 病毒形态的鉴定

将细胞试验分离阳性的样品细胞毒继续接种BHK21细胞，待细胞病变达80%～90%时，将细胞瓶内液体弃掉，加入0.25%胰酶进行消化。用PBS将分散的细胞吹打悬浮于灭菌离心管中，1000 r/min离心10 min后，弃上清；将细胞用PBS再次悬浮，1000 r/min离心10 min后，弃上清，用细胞固定液将细胞悬浮，准备用透射电镜鉴定病毒形态。电镜图片委托中国农业大学生命科学研究院电镜室制作。

1.2.5 乙脑病毒分离株E基因和PrM基因的RT-PCR扩增

(1)引物设计

参考GenBank中已发表的乙脑病毒核苷酸序列，采用Primer 5.0软件进行引物设计，其中E1-F/E1-R用于扩增E基因，PrM1-F/PrM1-R用于扩增PrM基因，引物的序列和位置见表1。

表1 用于扩增E基因和PrM基因的引物序列及位置

(2)病毒分离株RNA的提取

3株乙脑病毒分离株、JEV标准株、正常BHK21细胞，各取0.3 mL模板，按QIAGEN试剂盒说明书的操作步骤提取病毒RNA。

(3)反转录

反转录体系为：5×RNA PCR buffer 2.5 μL、dNTPsmixture 2.5 μL、RNase free dH2O 9.5 μL、随机引物1 μL、RNase inhibitor 1 μL、 AMV反转录酶0.5 μL、病毒RNA 8 μL，反应条件为：37℃ 90 min、42℃ 15 min、95℃5 min。

(4)PCR产物的扩增

以E1引物及PrM1引物，对分离株分别进行E基因和PrM基因扩增。利用Taq酶进行PCR，其反应体系为：10×buffer 2.5 μL，dNTP(mmol)2.5 μL,上下游引物(E1-F/E1-R或PrM1-F/PrM1-R)各1 μL，cDNA产物2.5 μL，Taq酶0.5μL，加去离子水总体积为25 μL，混匀后进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；最后72延伸5 min。

(5)PCR扩增产物的鉴定

反应结束后，取5 μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。将电泳结果阳性的PCR产物送上海生物工程技术服务有限公司测序。测序结果与Genbank中JEV核酸序列进行比对，从分子的角度来验证分离株是否是JEV。

1.2.6 乙脑分离株E基因的核苷酸同源性分析

利用Chen等建立的乙脑病毒基因分型方法，选择乙脑病毒E区的部分核苷酸序列，对3株分离株与已知的23株乙脑病毒代表株序列一起进行核苷酸同源性分析，构建乙型脑炎病毒遗传进化树[8，9，13]。

2 结果

2.1 病毒的分离

25个猪脑组织接种BHK21细胞，有3个脑组织(编号分别为3、12、23)接种的BHK21细胞72 h之内发生明显CPE，而且CPE达到80%以上，病变细胞表现圆缩，形成空斑。其他22个猪脑接种的BHK21细胞盲传3代后，均无CPE出现，视为分离阴性。

2.2 病毒的鉴定

2.2.1 免疫荧光试验

取25个猪脑组织接种的BHK21细胞滴片做免疫荧光试验，有3、12、23号脑组织出现强绿色荧光反应，其他22个脑组织无绿色荧光反应。

2.2.2 中和试验

3、12、23号脑组织感染细胞毒与兔抗JEV标准阳性血清反应的中和效价均为1∶64。

2.2.3 病毒形态的鉴定

电镜下可见正常细胞内无病毒颗粒出现，核膜完整，见图5。感染细胞核膜已被破坏，病毒颗粒有规律的排列在细胞核膜周围，病毒颗粒呈圆形，外周有囊膜和纤维突起，直径40 nm左右，见图6。所分离到的3株病毒分别命名为 JDY1、JDY2、JDY3。

图1 正常 BHK21细胞Fig.1 Normal BHK21 cells

图2 3号脑组织感染BHK21细胞Fig.2 Virus-infected BHK21cells in the No 3 brain tissue

图3 3号脑组织感染BHK21细胞与阴性血清反应Fig.3 Virus infected BHK21 cellsin theNo 3 brain tissueshow negative serum reaction.

图4 3号脑组织感染BHK21细胞与阳性血清反应Fig.4 Virus-infected BHK21 cells in theNo 3 brain tissueshow positive serum reaction.

图5 正常BHK21细胞在电镜下的形态Fig.5 Ultrastructure of normal BHK21 cells

图6 病毒分离株感染BHK21细胞在电镜下的形态Fig.6 Ultrastructural morphology of virus-infected BHK21 cells

2.2.4 分离株部分核苷酸的鉴定

(1)病毒分离株RNA的提取

3株乙脑分离株、JEV标准株、正常BHK21细胞，按试剂盒说明书的操作步骤提取病毒3 μL。

(2)乙脑病毒分离株E基因和PrM基因的RT-PCR扩增及鉴定

电泳结果显示，3株分离株均能扩增到约197 bp E基因和519 bpPrM基因的目的条带，电泳结果见图7和图8。扩增到的E基因和PrM基因测序结果与Genbank JEV序列比较，同源性均在95%～98%之间。

注：M：100 bp DNA Mark；1：JDY1；2：JDY2；3：正常;BHK21细胞；4：JDY3；5：JEV。图7 3株分离株E基因扩增电泳结果Note.M: 100 bp DNA marker; 1: JDY1; 2: JDY2; 3: Normal BHK21cells; 4: JDY3; 5: JEV.Fig.7 Electrophoresis results of E gene amplification of 3 isolates

注：M：100 bp DNA Mark；1：JEV；2：JDY1；3：JDY2；4：JDY3；5：正常BHK21细胞。图8 3株分离株PrM基因扩增电泳结果Note. M: 100 bp DNA marker; 1: JEV; 2: JDY1; 3: JDY2; 4: JDY3; 5: Normal BHK21 cells.Fig.8 Electrophoresis results of PrM gene amplification of 3 isolates

(3)乙脑分离株的基因分型

3株分离株与Beijing-1、GB30、Nakayama、SA14-14-2等23株乙型脑炎病毒参考序列的E基因核苷酸进行同源性分析，结果显示核苷酸同源性为95%～99%。3株分离株比较，JDY1和JDY2核苷酸同源性为99%，JDY1和JDY3核苷酸同源性为97%，JDY2和JDY3核苷酸同源性为97%。3株分离株与疫苗株SA14-14-2核苷酸同源性均为95%。

遗传进化树分析结果(见图9)显示，本次分离的3株新分离株JDY1、JDY2、JDY3与Beijing-1株亲缘关系最近，3株分离株均为GⅢ型乙型脑炎病毒。

3 讨论

随着生物、医学等学科的不断发展，实验用小型猪的应用越来越广泛。近年来我国实验用小型猪的开发利用也在逐年递增，但大部分小型猪为开放饲养，很难避免由蚊虫传播感染疾病，同时JEV对猪的感染也会对实验人员和饲养人员造成潜在威胁，尤其是乙型脑炎病毒。因此实验用小型猪JEV预防控制也受到相关部门的重视。本实验用于鉴定的25只小型猪是用于制定北京市小型猪地方标准做本底筛查样本小型猪的一部分，在样本采集之前没有接种过JEV疫苗。实验室同时对包括被鉴定的25只猪在内的共60只小型猪进行JEV血清抗体筛查，ELISA和IFA检测结果显示60只小型猪JEV抗体阳性率分别26.7%和28.3%[3，4]，与文献报道相符(20%～30%)[12]。被鉴定的25只小型猪ELISA和IFA检测JEV抗体阳性率均为24.0%(6/25)。虽然胡燕等(2006)和杨欣艳等(2007)分别通过血清学方法对北京小型猪感染JEV进行了报道，但并没有对病毒进行分离鉴定[14,15]。本实验通过病毒分离鉴定和抗体检测说明北京小型猪确实存在JEV的感染，同时实验也为北京市小型猪地方标准的修订及其不断完善提供了科学的参考数据。北京市于2011年发布了地方标准《实验用小型猪微生物学等级及监测》，将乙型脑炎病毒作为普通级小型猪必须检测项目[15]，但并没有对普通级小型猪是否进行JEV免疫接种提出要求，只是要求接种疫苗的普通级小型猪在疫苗接种有效期内群体免疫合格率达到70%以上[16]。实际通过本实验室近几年对北京市小型猪JEV的检测，还有部分猪场没有定期接种JEV疫苗或者没有完全按JEV免疫接种程序进行接种。定期按免疫程序接种疫苗的猪场，免疫合格率基本均能达到70%以上。通过本实验及文献[14]和文献[15]，建议猪场对普通级小型猪进行JEV疫苗的免疫接种，既能保障猪群免受JEV感染，也能保障饲养人员与实验人员的安全。

实验采用BHK21细胞培养法从25个小型猪脑组织中分离出3株疑似为JEV的毒株，根据细胞病变情况，说明能分离到活的病毒；3株分离株病变细胞滴片与JEV抗血清能够产生强绿色免疫荧光反应；3株分离株细胞毒能中和JEV标准抗血清，中和效价均为1：64；3株分离株经扫描电镜形态鉴定，为直径约为40nm的有囊膜病毒，符合JEV特征；经E基因和Prm基因部分核酸序列分析，与GenBank中JEV核苷酸同源性为95%～99%。充分证明分离到的3株猪源病毒为JEV。

本实验是国内首次从小型猪种群中分离到JEV。通过部分核苷酸序列分析，JDY1、JDY2、JDY3与Beijing-1核苷酸同源性分别为98%、98%和97%，与SA14-14-2 疫苗株核苷酸同源性均为95%。通过E基因遗传进化树分析3株分离株均为GIII JEV。

图9 3株新分离乙脑病毒E基因系统进化树分析Fig.9 Phylogenetic analysis of JEV E gene of three newly isolated strains

通过农业部批准SA14-14-2减毒疫苗可用于猪乙型脑炎病毒的预防接种[17]，足见国家对预防猪乙型脑炎病毒感染的重视。实验通过对分离到得北京猪源JEV的初步鉴定，证明近年在北京流行的仍然为与SA14-14-2减毒株亲缘关系很近的GIII JEV。进一步证明SA14-14-2疫苗可以用于猪感染JEV的预防接种，不仅对从源头上控制饲养人员和实验人员JEV的感染很有意义，而且对养猪业的发展也很有意义。

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Isolation and identification of Japanese encephalitis virus in the experimental minipigs

WANG Ji, FU Rui, LI Xiao-bo, WANG Shu-jing,GONG Wei, WEI Li, YUE Bing-fei*,HE Zheng-ming*

(National Institutes for Food and Drug Control, National Center for Quality of Laboratory Animals, Beijing 100050, China)

Objective To understand the characteristics of minipigs infected withJapanese encephalitis virus(JEV).Methods After the brain tissues were treated, the pig brain tissue treatment solution was inoculated with BHK21 cells. Then, virus culture,indirect immunofluorescence assay, neutralization test, electron microscopic observation, and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) amplification of the new isolate E segment and PrM segment nucleotide sequence were performed and the genotype was identified.Results BHK21 cells were inoculated into 25 pigbrain tissues. Among them, three tissue-treated fluid couldinduce shrinkage and aggregation of BHK21 cells, and immunofluorescence staining showed strong green fluorescence response. The results of neutralization test showed that the neutralization titer of these three new isolates was 1:64, and the size of the virus particles was about 40nm under the electron microscope. The homology of both RT-PCR product sequencing results and E-segment of vaccine strain were 95%. Three new isolates were type GIII JEV.Conclusion The results ofthisstudydemonstrate that there is G III type Japanese encephalitis virus infection in the minipig farm.

Japanese encephalitis virus, JEV; Isolation; Identification

王吉(1974-)，女，副研究员，从事微生物学和免疫学研究。Email:wj_nd_jds@sina.com

岳秉飞(1960-)，男，研究员，研究方向：实验动物学。Email：y6784@126.com 贺争鸣(1957-)，男，研究员，研究方向：微生物学和免疫学。E-mail: zhengminghe57@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0057-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.011

2016-07-25