温阳活血方对慢性心衰大鼠心肌组织转化生长因子β1的影响

王 健，刘 丽

（广东省深圳市福田区中医院心内科，广东 深圳 518033）

论 著

温阳活血方对慢性心衰大鼠心肌组织转化生长因子β1的影响

王 健，刘 丽

（广东省深圳市福田区中医院心内科，广东 深圳 518033）

目的：观察温阳活血方对慢性心力衰竭大鼠心肌组织转化生长因子β1（TGF-β1）的影响。方法：利用肾上腹主动脉缩窄法制备慢性心力衰竭大鼠模型30只随机分为3组各10只，温阴活血方组给予温阳活血方（8mL/kg）每日灌胃，假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃，假手术组只分离服主动脉通不结扎。观察各组大鼠左心室重量指数（LVMI）和胶原容积积分（CVF），RT—PCR测定各组大鼠左心室心肌TGF-β1mRNA表达水平。结果：与假手术组比较，模型组LVMI、CVF明显升高，左心室心肌TGF-β1mRNA表达明显升高（P＜0．05）；与模型组比较，温阳活血方组LVMI、CVF明显下降，左心室心肌TGF-β1mRNA表达明显下降（P＜0．05）。结论：温阳活血方通过影响信号通路中TGF-β1mRNA的表达而改善心衰大鼠心肌纤维化程度。

慢性心力衰竭；大鼠模型；温阳活血；转化生长因子影响

心室重塑是心衰的基本发病机制，心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重构的主要表现之一［1］。近年来发现某些细胞因子与MF的关系密切，被认为是各种促MF因素作用的最后共同环节。转化生长因子- β（ transforming growth factor-β，TGF-β）在心肌纤维化发生、发展过程中具有促进肌性成纤维细胞的转化，促进胶原基因表达，促进细胞外基质合成与沉积等作用，是最重要的促心肌纤维化细胞因子之一［2］。本研究旨在探讨温阳活血方对慢性心力衰竭大鼠心肌组织转化生长因子β1（TGF-β1）的影响，为防治MF提供新的理论依据。

1 实验材料

实验动物。清洁雄性Wistar大鼠30只，体质量200～220g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：粤监证字2012C066。

试药。温阳活血方桂枝0.5g/6g（表示药物生粉量是0.5g相当于原药物剂量6g），制附子0.7g/6g，红参1.2g/5g，黄芪2g/10g，三七末1.5g/2g，茯苓0.5g/10g，丹参1.5g/10g，郁金1g/10g，赤芍2g/10g，葶苈子1g/10g。三九医药公司提供中药免煎剂各1包，加开水至100mL，每日按8mL/1kg［3］大鼠灌胃。

试剂。PT-PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司，批号RR390A，Trizol（心肌总RNA抽提试剂）购自美国Invitrogen公司，TGF-β1引物（上海生工公司合成，批号5596-026）。

主要仪器。实时荧光定量PCR仪（美国ADI公司，型号T300），L6型紫外分光光长度计（上海仪电仪器有限公司），2E型紫外透射反射分析仪（上海骥辉科学分析仪器有限公司）。

2 方 法

动物分组。30只大鼠随机分为3组，假手术组、模型组、温阳活血方组，每组10只。

造模。参照文献［4］建立大鼠慢性心力衰竭（congestive heart failure，CHF）模型。用3%戊巴比妥钠0.15 mL／100g腹腔注射麻醉，腹部正中剑突下切开皮肤2～3cm，打开腹腔，在左肾动脉上方分离腹主动脉，穿过1条0号丝线，将去尖磨钝的7号手术针置于丝线处，结扎丝线，迅速抽取手术针，检查腹主动脉通畅后分层关腹。术后均给予连续3天腹腔青霉素20万U注射。常规喂养4周，大鼠逐渐出现呼吸、心跳加快、倦怠无力、食欲减退等表现，并检测血流动力学参数，以左心室舒张末压（LVEDP）≥15mmHg作为模型成功标准。假手术组只分离腹主动脉而不结扎。成功建立模型后，温阳活血方组给予温阳活血方按8mL/（kg·d）大鼠灌胃。模型组和假手术组给予等量生理盐水灌胃，连续4周。

3 检测指标

左心室重量指数（LVMI）。处死大鼠后，迅速开胸取出心脏，用0.9%氯化钠清洗，滤纸吸干，称重；沿房室环剪去心房及右室游离壁，称重，余下的左室游离壁和室间隔测定左室质量，左室质量与体质量的比值为左室质量指数（LVMI，mg/g）。

Masson染色和胶原容积分数检测。每只大鼠选取左室中段横截面心肌，3张组织切片进行Masson染色，采用Biosens Digital Imaging System医学图像分析系统，每组大鼠心肌病理切片中随机选取10高倍个视野（×400）测量选定区域染色组织的面积（胶原染色呈红色），计算胶原面积与心肌组织总面积的比值，取其均值为胶原容积分数（CVF）。

R T-P C R检测心肌T G F-β1m R N A表达水平。用Trizol提取心肌总RNA，紫外分光光度计（A260nm/A280nm）测量总RNA的量，取2μL 总RNA行RT-PCR扩增。大鼠TGF-β1上游引物序列：TGGACCGCAACAACGCAATCTA，下游引物：CACCTCGACGTTTGGGACTGATC，扩增产物为396 bp；β-actin作为内参上游引物：GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC，下游引物：CATCTGCTGGAAGGTGGACA，扩增产物为452bp。扩增条件：取3μg总RNA为模板逆转录成cDNA，PCR反应条件为：94℃，2min；94℃，30s；50℃～65℃，30s；72℃，1min，第2步起循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，采用ZF型紫外透射反射分析仪摄像，采用Quantity-4.6.2软件分析照片中目的条带的灰度值，并计算各目的条带与其相应内参β-actin的灰度值比值。

4 结 果

各组LVMI与CVF比较见表1。

表1 各组LVMI与CVF比较 （±s）

表1 各组LVMI与CVF比较 （±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，与模型组比较，△P＜0.05。

组别 n LVMI（mg/g-1） CVF（%）假手术组 10 2.07±0.36 12.11±2.02模型组 10 2.89±0.79*27.09±7.12*温阳活血方组 10 2.46±0.23△16.83±2.79△

各组RT-PCR检测TGF-β1mRNA表达水平见表2。

表2 各组大鼠心肌TGF-β1mRNA表达水平比较 （±s）

表2 各组大鼠心肌TGF-β1mRNA表达水平比较 （±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别 n TGF-β1假手术组 10 0.92±0.12模型组 10 1.98±0.53*温阳活血方组 10 1.24±0.23△

5 讨 论

MF是指在心肌间质中胶原纤维过量积聚，心组织中胶原浓度升高或胶原成分发生改变，可引起心力衰竭，心律失常，心源性猝死等严重并发症，因此阻止心肌纤维化的发生，延缓及其发展对提高心脏疾病的生存率有重要意义［5］。本实验中与假手术组相比，模型组LVMI增加、CVF浓度增加，说明模型组出现心肌肥厚。

研究表明，TGF-β1过度表达可促进心肌纤维化和心肌肥厚而导致心室重构，参与心肌纤维化发生的早期过程［6］。TGF-β1是一类多功能细胞因子，在纤维化的发生、发展过程中起着重要作用，是组织器官纤维化的主要调控因子之一［7］，其高表达具有促组织发生纤维化的病理作用，它可促进细胞外基质的合成与分泌，减少细胞外基质的降解，增加胶原与基质蛋白的生成，最终导致心肌细胞外基质的沉积，从而引起心肌纤维化［8］。转化生长因子-β（TGF-β）是由多种细胞分泌的一类具有广泛生物学效应的生长因子，对心血管系统有多种病理生理作用。Smads蛋白是TGF-β1下游的细胞内信号转导和调节分子。Smads蛋白是TGF-β唯一的作用底物，能将TGF-β信号从细胞外传递到细胞核的中介分子，是该信号通路中的关键步骤，其分子组成与调节复杂，与其他信号通路存在广泛的交互影响，对心肌纤维化、心肌肥大等的发生和发展有明确的作用近年研究表明，TGF-β/Smads信号转导通路与多种心血管疾病的发生、发展密切相关［9］，作为TGF-β1下游的信号蛋白介导TGF-βI的促纤维化作用，是引起MF的重要细胞因子之一。本实验中，与假手术组比较，模型组大鼠的左室心肌，TGF-β1表达明显增加，说明，TGF-β1在MF和心室重塑进程中发挥重要作用。

温阳活血法是目前治疗心衰最常用的方法。多年的临床证实，温阳活血方对心衰有明显的疗效。方中单药具有降压、调脂、改善血流动力学和内皮细胞的功能［10-11］，可显著抑制心肌纤维化［12-14］。温阳活血方药中黄芪、桂枝益气通阳；制附子温阳宣肺利水；丹参、赤芍活血化瘀通痹，治疗血分之瘀滞；红参、三七益气活血、通络止痛；桂枝、葶苈子、茯苓能增加冠状动脉血流，增强心肌收缩力，减慢心率，心输出量；茯苓、桂枝有显著利尿作用，能促进水湿排出，减轻心肌负荷。黄芪具有强心、降低总外周阻力、扩张冠状动脉、改善微循环、降低心肌耗氧，以及抗氧自由基、保护细胞功能等作用。

实验结果显示，与模型组比较温阳活血方组LVMI、CVF明显下降，TGF-β1mRNA表达明显下降，说明温阳活血中药能抑制心肌肥厚，其减轻MF、改善心脏功能的作用，可能与其抑制心肌组织TGF-β1mRNA的过度表达有关。

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Objective：To observe the effect of WenYang HuoXue Decoction on the expression of TGF-β1 in rats with chronic heart failure.Method：A CHF model of rat was established by constricting the abdominal aorta superior to renal artery.30 male Wistar rats were randomly divided into sham operation group，model group，and WenYang HuoXue Decoction group, 10 rats in each group. WenYang HuoXue Decoction group were given WenYang HuoXue Decoction（8kg/kg） by intragastric administration everyday. Their LVMI and CVF was measured and TGF-β1 mRNA in the left ventricular myocardium were assessed by RT—PCR.Result：The LVMI、CVF and TGF-β1 mRNA were significantly higher in model group than that in sham operation（P＜0.01）.The LVMI、CVF and TGF-β1 mRNA were significantly lower in WenYang HuoXue group than that of the model group（P＜0.01）.Conclusion：WenYang HuoXue Decoction could significantly improve myocardial fibrosis through decreasing the over-expression of TGF-β1 mRNA.

Chronic heart failure；Rat model；WenYang HuoXue Deccotion；Connective tissue growth factor

R256.214.61

B

1004-2814（2017）02-0110-03

2016-10-18