液相色谱-串联质谱法测定大鼠血浆中靛蓝的浓度及药动学研究

孔树佳，李砚文（昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院药剂科，昆明 650118）

液相色谱-串联质谱法测定大鼠血浆中靛蓝的浓度及药动学研究

孔树佳＊，李砚文#（昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院药剂科，昆明 650118）

目的：建立测定大鼠血浆中靛蓝浓度的方法，研究靛蓝在大鼠体内的药动学特征。方法：将18只大鼠随机分为低、中、高剂量组，每组6只，分别ig 10、20、40 mg/kg的靛蓝溶液。分别于给药前和给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、16、24、48、72 h眼眶采全血0.3 mL，分离血浆，甲醇沉淀后采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法测定靛蓝的血药浓度。色谱柱为Agilent Poroshell EC-C18，流动相为甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液（95∶5，V/V），流速为0.4 mL/min；以多反应监测（MRM）模式进行定量分析，用于监测的离子对（m/z）为263.1～218.8（靛蓝）和237.2～194.1（卡马西平，内标）；采用DAS 3.0软件计算药动学参数。结果：靛蓝检测质量浓度的线性范围为0.5～100 ng/mL（r＝0.999 9），日内、日间RSD均小于9%（n＝5），低、中、高质量浓度的质控样品的基质效应分别为（98.25±3.71）%、（102.23±2.64）%、（102.29±3.79）%（n＝5）。靛蓝在低、中、高剂量组大鼠体内的tmax分别为（8.6±1.1）、（9.2±0.8）、（9.5±0.8）h，cmax分别为（30.9±8.6）、（44.9±10.1）、（96.1±17.4）ng/mL，t1/2分别为（14.9±2.1）、（16.3± 2.9）、（15.3±3.7）h，AUC0-72h分别为（366.6±83.4）、（694.9±105.8）、（1 223.42±108.7）ng·h/mL。结论：本方法灵敏度高、特异性好，可用于大鼠血浆样品中靛蓝的含量测定；靛蓝在大鼠体内药动学特征符合非房室模型。

靛蓝；液相色谱-串联质谱法；大鼠；血浆；药动学

青黛，别名靛花、蓝靛，主要含靛蓝、靛玉红、色胺酮和青黛酮等活性成分，具有清热解毒、消肝泻火、凉血止血、定惊之功效。近年来，青黛类中药被广泛用于内科、外科、儿科、妇科、传染科等病症的治疗，引起了国内外研究者的重视[1]。靛蓝是青黛的主要成分之一，具有抗病毒作用[2]，对幽门螺旋杆菌的体外抗菌活性较好[3-4]，但其体内过程文献报道较少。目前对于靛蓝的分析方法主要有高效液相色谱（HPLC）法[5]、气相色谱-质谱联用（GC-MS）法[6]和液相色谱-质谱联用（LC-MS）法[7]，大多用于中药质量标准评价或体外试验测定，样品分析时间长、样品前处理方法复杂、定量下限高，均不太适合用于生物样本分析及体内过程评价。在本研究中，笔者拟以卡马西平为内标，建立以液相色谱-电喷雾串联质谱（LC-MS/MS）法[8]测定大鼠血浆中靛蓝含量的分析方法，并将其用于靛蓝在大鼠体内的药动学研究。

1 材料

1.1 仪器

5500 Q TRAPTM质谱仪，配有电喷雾（ESI）离子源（美国AB Sciex公司）；30A系列超HPLC仪（日本岛津公司）；H1650-W高速台式离心机（湖南湘仪实验室开发有限公司，离心半径：20 cm）。

1.2 药品与试剂

靛蓝对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：110716-201111，纯度：≥98%）；卡马西平对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100142-201004，纯度：≥99%）；甲醇、乙酸铵为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为Milli-Q超纯水。

1.3 动物

SD大鼠，♂，体质量200～220 g，购自第三军医大学实验动物中心，动物合格证号为SCXK（军）2007-015、SCXK（渝）2007-0003。实验所使用大鼠的购买、实验处置都严格遵循《第三军医大学实验动物管理暂行规定》。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取靛蓝对照品适量（相当于靛蓝10.0 mg），置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释制成质量浓度为1.0 mg/mL的贮备液。精密量取上述贮备液10µL，加入990µL甲醇，涡旋混匀，得10 μg/mL的对照品溶液，－20℃下保存，备用。

2.1.2 内标溶液 精密称取卡马西平对照品10.11 mg（相当于卡马西平10.0 mg），置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释制成质量浓度为1.0 mg/mL的贮备液。精密量取上述贮备液10µL，加入990µL甲醇，涡旋混匀，制得10 μg/mL的内标溶液，－20℃下保存，备用。

2.2 色谱条件与质谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell EC-C18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）；流动相：甲醇-5 mmol/mL乙酸铵溶液（95∶5，V/V，pH 6.8），流速：0.4 mL/min；柱温：25℃；进样量：2 μL。

靛蓝和卡马西平的离子化采用ESI离子源，正离子模式，以多反应监测（MRM）模式分析。离子源参数：气帘气为39 psi（1 psi＝6 895 Pa），雾化气为88 psi，辅助加热气为89 psi，离子源温度为500℃，离子源电压为5 000 V。四级杆参数：靛蓝监测离子对（m/z）为263.1～218.8，去簇电压（DP）为60 eV，碰撞能量（CE）为33 eV，碰撞池出口电压（CXP）为3.3 eV；卡马西平监测离子对（m/z）为237.2～194.1，DP为100 eV，CE为26.3 eV，CXP为5.9 eV。

2.3 样品处理

将40 ng/mL内标甲醇溶液1 mL加入到0.1 mL样品中，涡旋混匀2 min，13 000 r/min离心5 min，取上清过0.22 μm微孔滤膜，滤液供LC-MS/MS上样分析。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 按相关专属性试验方法检测发现，在正离子模式下，靛蓝和内标产生了质子化的母离子[M+1]+。质谱图中可观察到，靛蓝主要的离子为m/z 263.1，内标主要的离子为m/z 237.2；靛蓝强度最高的子离子为m/z 218.8，内标强度最高的子离子为m/z 194.1。在“2.2”项条件下，内源性杂质对待测物无干扰，靛蓝和内标峰形良好，保留时间分别为2.92、2.16 min。靛蓝和内标的质谱图见图1，LC-MS/MS图见图2。 40、20、5、2、1、0.5 ng/mL的质控样品，按“2.3”项下方法处理后，进样测定。以靛蓝的峰面积和内标峰面积的比值（y）与靛蓝的质量浓度（x）进行回归分析，得回归方程为y＝0.049 3x+0.015 9（r＝0.999 9）。结果表明，靛蓝检测质量浓度的线性范围为0.5～100 ng/mL，定量下限为0.5 ng/mL。

图1 靛蓝和内标的质谱图Fig 1 Spectrometry of indigo and internal standard

图2 液相色谱-串联质谱图Fig 2 LC-MS/MS spectrometry

2.4.3 基质效应考察 分别以甲醇沉淀后的大鼠空白血浆和去离子水为溶剂，制备靛蓝低、中、高质量浓度（1、10、80 ng/mL）的样品，每个质量浓度5份，按“2.3”项下方法处理后，进样测定。基质效应（%）＝沉淀后空白血浆制备样品的峰面积/去离子水制备样品的峰面积× 100%；内标归一化的基质效应（%）＝靛蓝的基质效应/内标的基质效应×100%。基质效应考察结果见表1。

表1 基质效应考察结果（±s，n＝5）Tab 1 Results of matrix effects（±s，n＝5）

表1 基质效应考察结果（±s，n＝5）Tab 1 Results of matrix effects（±s，n＝5）

待测物靛蓝内标归一化的基质效应，% 94.83±8.27 98.63±6.62 98.72±6.12加入量，ng/mL 1 10 80 40内标基质效应，% 98.25±3.71 102.23±2.64 102.29±3.79 103.87±6.21

2.4.2 线性关系与定量下限考察 取大鼠空白血浆加入适量的靛蓝对照品溶液，分别制备成含靛蓝100、50、

2.4.4 精密度和准确度试验 制备低、中、高质量浓度（1、10、80 ng/mL）的质控样品，每个质量浓度5份，按“2.3”项下方法处理后，进样测定，连续测定3 d，考察日内、日间精密度和准确度。结果显示，低、中、高质量浓度质控样品的日内RSD分别为8.13%、1.93%、2.48%（n＝5），日间RSD分别为3.27%、4.36%、4.85%（n＝3），准确度分别为94.2%、103.2%、108.72%（n＝5）。

2.4.5 稳定性试验 制备低、中、高质量浓度（1、10、80 ng/mL）的质控样品，分别置于室温下4 h（n＝5）、自动进样器内24 h（n＝5）、－80℃下14 d（n＝5）、－80℃反复冻融3次（n＝5），再按“2.3”项下方法处理后进样测定，考察稳定性。结果显示，RSD均小于15%，表明靛蓝的血浆样品在上述条件下均稳定。

2.5 药动学实验

将18只大鼠随机分为低、中、高剂量组，每组6只，分别ig 10、20、40 mg/kg的靛蓝溶液。分别于给药前和给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、16、24、48、72 h眼眶采血0.3 mL并抗凝，常温下4 000 r/min（离心半径：20 cm）离心5 min分离血浆后，－80℃下冻存。采用LC-MS/MS法测定血浆中靛蓝的浓度，绘制药-时曲线。各组大鼠体内靛蓝的药-时曲线见图3。

采用DAS 3.0软件，按非房室模型测定靛蓝的主要药动学参数。结果显示，靛蓝在大鼠体内9 h左右达到峰浓度，t1/2约为15 h，cmax、AUC0-72h、AUC0-∞相对于给药剂量呈近似线性的变化。各组大鼠体内靛蓝的药动学参数见表2。

图3 各组大鼠体内靛蓝的药-时曲线（n＝6）Fig 3 Concentration-time curves of indigo in rats in vivo in each group（n＝6）

表2 各组大鼠体内靛蓝的药动学参数（±s，n＝6）Tab 2 Pharmacokinetic parameters of indigo in rats in vivo in each group（±s，n＝6）

表2 各组大鼠体内靛蓝的药动学参数（±s，n＝6）Tab 2 Pharmacokinetic parameters of indigo in rats in vivo in each group（±s，n＝6）

参数tmax，h cmax，ng/mL t1/2，h MRT，h CL，L/h·kg AUC0-72h，ng·h/mL AUC0-∞，ng·h/mL低剂量组8.6±1.1 30.9±8.6 14.9±2.1 19.2±5.9 10.3±2.2 366.6±83.4 398.7±64.6中剂量组9.2±0.8 44.9±10.1 16.3±2.9 20.9±1.5 10.9±1.4 694.9±105.8 740.8±96.3高剂量组9.5±0.896.1±17.415.3±3.718.9±2.212.7±1.1 1 223.4±108.7 1 263.2±108.9

3 讨论

3.1 色谱条件优化

大鼠血浆中靛蓝测定方法建立过程中，提高检测的灵敏度是一个比较关键的问题。本实验参考文献[9-10]对方法建立过程的多个环节进行了优化，使得定量下限为0.5 ng/mL。

笔者比较了水、乙腈、甲醇、甲醇-乙腈（1∶1，V/V）、甲醇-水（1∶1，V/V）、乙腈-水（1∶1，V/V）和甲醇-乙腈-水（1∶1∶1，V/V/V）、含0.1%甲酸的甲醇、含0.1%甲酸的乙腈、含0.1%甲酸的水、含0.1%甲酸的甲醇-乙腈（1∶1，V/ V）、含0.1%甲酸的甲醇-水（1∶1，V/V）、含0.1%甲酸的乙腈-水（1∶1，V/V）和含0.1%甲酸的甲醇-乙腈-水（1∶1∶1，V/V/V）对靛蓝对照品的溶解效果，发现甲醇的溶解效果最好，且超声（60 Hz，40℃）就能产生助溶效果。

笔者比较了乙腈和甲醇对待测物和内标的洗脱效果，发现甲醇洗脱所得色谱峰更窄、峰形更好、灵敏度更高；比较了甲醇-水和甲醇-乙酸铵缓冲盐体系，发现若体系中没有乙酸铵，则有拖尾现象，而在流动相中添加5 mmol/L乙酸铵后，对峰形有较大的改善。

笔者比较了等度洗脱[甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液（体积比依次为80∶20、85∶15、90∶10、95∶5）和甲醇]和梯度洗脱的效果，发现甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液（95∶5，V/V）洗脱时灵敏度最高，且出峰时间最短。

3.2 给药剂量的设定

在前期的预实验中，笔者进行了给药剂量的摸索，分别给予5、10、20、40、80 mg/kg，每个剂量组2只大鼠。结果发现5 mg/kg给药剂量所测得的药-时曲线上的点有1/3在本方法的定量下限以下，而80 mg/kg给药剂量所得的药-时曲线在tmax附近的点有超限的现象，在10～40 mg/kg的给药剂量范围内所测定的血药浓度都在工作曲线的线性范围内，故本实验采用10、20、40 mg/kg为给药剂量。

3.3 取血时间点的设定

在前期的预实验中，笔者通过每组2只大鼠所测定的血药浓度，采用DAS 3.0软件处理后获得的tmax在8.5 h左右。根据采样时间点的设计原则，即兼顾药物的吸收相（吸收相至少需要2～3个采样点）、平衡相（在cmax附近至少需要3个采样点）和消除相（需要4～6个采样点），整个采样时间至少应持续到3～5个半衰期，据此笔者设定了本研究的采血时间点。

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（编辑：邹丽娟）

Concentration Determination of Indigo in Rats’Plasma by LC-MS/MS and Its Pharmacokinetics Study

KONG Shujia，LI Yanwen（Dept.of Pharmacy，the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University/ Yunnan Provincial Tumor Hospital，Kunming 650118，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the concentration determination of indigo in rats’plasma，and study the pharmacokinetic characteristics in rats in vivo.METHODS：18 rats were randomly divided into low-dose，medium-dose，high-dose＊主管药师，硕士。研究方向：临床药物治疗、药事管理。电话：0871-68217128。E-mail：vampireicecream@163.com#通信作者：主治医师。研究方向：肿瘤危重症治疗。电话：0871-68185656-2036。E-mail：liyw20008@163.comgroups，6 in each group，which were intragastrically administrated 10，20，40 mg/kg of indigo solution.The sample blood 0.3 mL was taken from eye socket before administration and 0.083，0.25，0.5，0.75，1，2，4，6，8，10，12，16，24，48，72 h after administration，separating the plasma，then LC-MS/MS was used to determine the plasma concentration of indigo after methanol precipitation.The column was Agilent Poroshell EC-C18with mobile phase consisting of methanol-5 mmol/L ammonium acetate solution（95∶5，V/V）at a flow rate of 0.4 mL/min；multiple reaction monitoring was conducted for the quantitative analysis，with ion pair of 263.1-218.8（indigo）and 237.2-194.1（carbamazepine，internal standard）.Pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 3.0 software.RESULTS：The linear range of indigo was 0.5-100 ng/mL（r＝0.999 9），intra-day and inter-day RSDs were lower than 9%（n＝5）；matrix effects of low，medium and high does quality control samples were（98.25±3.71）%，（102.23± 2.64）%，（102.29±3.79）%（n＝5）.The pharmacokinetic parameters of indigo in low-dose，medium-dose，high-dose groups were tmaxof（8.6±1.1），（9.2±0.8）and（9.5±0.8）h；cmaxof（30.9±8.6），（44.9±10.1），（96.1±17.4）ng/mL；t1/2of（14.9±2.1），（16.3±2.9），（15.3±3.7）h；AUC0-72hof（366.6±83.4），（694.9±105.8），（1 223.42±108.7）ng·h/mL，respectively.CONCLUSIONS：The method shows high sensitivity，good specificity，and can be used for the content determination of indigo in plasma samples of rats.The pharmacokinetics of indigo in rats in vivo fits non-compartment model.

Indigo；LC-MS/MS；Rats；Plasma；Pharmacokinetics

R965

A

1001-0408（2017）07-0912-04

2016-07-25

2016-12-19）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.14