对节白蜡ISSR—PCR反应体系的建立与优化

程建如++周明芹

摘要：以对节白蜡（Fraxinus hupehensis Chiú，Shang et Su）基因组DNA为材料，采用正交试验和单因子试验对其ISSR-PCR反应体系进行了构建与优化。结果表明，在15 μL反应体系中含DNA模版40 ng、引物终浓度0.7 μmol/L、7.5 μL 2×Taq PCR Plus Master Mix的扩增效果最好。该反应体系筛选出了14条稳定性强、多态性高、扩增效果较好的ISSR引物，并通过梯度PCR试验比较引物在不同退火温度下的扩增效果，从而确定引物最佳退火温度。

关键词：对节白蜡（Fraxinus hupehensis Chiú，Shang et Su）；ISSR-PCR；反应体系；单因子试验；正交设计

中图分类号：Q78；Q943.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）22-5962-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.058

Establishment and Optimization of Fraxinus hupehensis ISSR-PCR Reaction System

CHENG Jian-ru， ZHOU Ming-qin

（College of Horticulture and Landscape Architechture，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）

Abstract：The single factor test and orthogonal design were used to establish and optimize the ISSR-PCR reaction system of Fraxinus hupehensis Chiú，Shang et Su. The results showed that the appropriate PCR reaction system consisted of 40 ng template DNA，0.7 μmol/L primer，and 7.5 μL 2×Taq PCR Plus Master Mix.14 high-efficient polymorphic primers were screened out based on the optimal ISSR reaction system.Furthermore，the ideal annealing temperature of the every selected primer was decided according to the amplified results with different temperatures.

Key words：Fraxinus hupehensis； ISSR-PCR； reaction system； single factor test； orthogonal design

对节白蜡（Fraxinus hupehensis Chiú，Shang et Su）为木犀科白蜡属的落叶乔木，又名湖北白蜡、对节树、湖北梣，特产于湖北省，1990年被正式定为国家二级珍稀濒危保护植物[1]。该种仅分布于湖北省钟祥与京山接壤地区，多生长在海拔100～600 m的土层深厚的山坡、沟谷、水积平台及村边路旁，在群落中多沿山坡向沟谷逐渐加大，甚至形成小片纯林[2]。该物种生长缓慢，具有很高观赏价值；材质优良，既是珍贵的用材树种，又是优美的园林绿化树种，还是极佳的盆景、根雕素材，被誉为“活化石”或“盆景之王”，此外还具有很高的药用价值。近年来，由于重利用轻保护，乱砍滥伐，尤其是为制作树桩盆景，节白蜡野生资源遭到过度采挖，破坏严重。因此，了解对节白蜡野生资源的现状，加强基础研究，探讨其濒危机制，制定资源保护与合理利用之对策已属当务之急。

目前，有关对节白蜡的研究较少，主要集中在资源调查[3]、育苗技术[4]、植物组织培养[5]、化学成分和药理作用[6]等几个方面。但有关对节白蜡分子遗传标记的研究国内外尚未见报道。ISSR（Inter-simple sequence repeat），又称为Inter-SSR，即简单重复序列区间，属于第二代DNA分子标記，是Zietkiewicz等[7]于1994年在SSR标记基础上发展起来的。ISSR技术是利用在植物基因组中常出现的SSR本身设计引物，使位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组片段进行PCR扩增。由于SSR在真核生物中分布广泛，且串联重复的数目具有高度多态性[8]，因而ISSR-PCR可以检测基因组中丰富的遗传变异。此外，ISSR技术操作简单快速，引物来源简单，试验成本较低[9]。因此已广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、进化及遗传多样性等方面的研究[10-13]。本研究以对节白蜡基因组DNA为模板，对其ISSR反应体系进行构建与优化，为后期对节白蜡种质资源在分子水平的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

所用材料分别采自钟祥市鸡鸣寺林场雷冲分场、雁门口镇和杨集镇，3份材料样本编号分别为17、145、234。样本为当年生嫩叶，叶片上的灰尘用自来水洗干净，后用吸水纸将残留的水分吸干，然后去除叶柄，将叶片迅速放入自封袋，加变色硅胶后封口保存。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取与检测 对节白蜡基因组DNA提取采用改良CTAB法[8]，用Thermo Scientific Nano Drop 2000C分光光度计仪检测其纯度和浓度，1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。

1.2.2 ISSR-PCR反应体系正交试验设计 PCR反应体系采用2×Taq PCR Plus Master Mix（包括Taq DNA Polymerase、2×Taq PCR Buffer、Mg2+、dNTP Mix），故本研究涉及的ISSR-PCR反应体系影响因子只有2个：模板DNA用量和引物用量。本研究首先采用正交试验设计初步的反应体系（表1）。反应的总体积为15 μL，除含两个变化因素外，还含有7.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，其余用RNase-Free Water补足至15 μL。引物选用UBC873，该引物序列为：GACAGACAGACAGACA。

扩增反应结束后，取5 μL PCR扩增产物在含有GelRed核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶于1×TAE缓冲液中电泳，电压设定为120 V，电泳时间30 min，待电泳结束取出凝胶，在凝胶成像系统观察并成像分析。

1.2.3 ISSR-PCR反应体系单因子试验 以正交试验中扩增效果反应效果较好的体系为基础，再设计单因子试验，进一步筛选反应体系中引物和模版DNA的浓度。DNA模板（50 ng/μL）的候選用量：0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 μL；10 μmol/L引物的候选用量：0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05、1.20、1.35 μL。

1.2.4 ISSR-PCR扩增程序的优化 利用正交试验和单因子试验确定的优化ISSR-PCR反应体系，筛选PCR的循环次数和引物最佳退火温度。PCR循环数从33～40共8个处理；根据引物碱基序列计算理论退火温度，设定退火温度梯度范围（在引物理论退火温度上下5 ℃内筛选最佳值），根据凝胶成像结果确定引物最佳退火温度。

2 结果与分析

2.1 DNA浓度与纯度检测结果

提取的对节白蜡基因组DNA呈白色絮状沉淀，电泳凝胶结果显示，DNA为一条亮带，提取的DNA质量较好。DNA的OD260 nm/OD280 nm多数在1.70～1.90之间，纯度较高，符合ISSR-PCR对DNA的要求（图1）。

2.2 ISSR-PCR正交试验结果

根据正交试验设计的16个反应体系进行PCR扩增，PCR产物由脂糖凝胶电泳检测并拍照（图2）。以特异性带多、主带清晰、副带较为明显为佳，观察比较电泳图谱，确定体系13的扩增效果较好。

2.3 DNA模版用量的优化

ISSR扩增反应由于不同物种所需要的最佳模板DNA浓度不同，因此，确定合适的模板DNA浓度是进行ISSR-PCR反应的必要试验。从图3中可以看出，模板DNA为20～90 ng时条带亮度和多态性差异不大，都能扩增出较为清晰的条带。因此，模版DNA的浓度对对节白蜡ISSR-PCR反应影响不是很敏感，在后续的15 μL PCR反应中选用40 ng模板DNA。

2.4 引物浓度的优化

从图4可以看出，引物浓度对对节白蜡ISSR-PCR扩增反应的影响较为大。在设置的8个不同浓度梯度中，引物浓度为0.2～0.3 μmol/L时，扩增出条带较模糊，且条带也少；当引物浓度到0.8～0.9 μmol/L时，引物特异性降低，片段模糊不清；当引物浓度在0.4～0.7 μmol/L时，扩增出条带较清晰，片段大小基本一致，而引物浓度在0.7 μmol/L时扩增效果最好，因此，ISSR-PCR反应的适宜引物浓度为0.7 μmol/L。

2.5 循环次数的优化

ISSR-PCR反应循环次数对产物有较明显的影响，反应循环次数少，产物累积不够，检测不出目的条带，但循环次数多，产物累积多，易出现非特异产物。图5显示8个不同的PCR循环次数对ISSR-PCR扩增反应的影响。从图5可以看出，循环次数为33～35时，扩增出的条带模糊不清；当循环次数为36～39时，所扩增的条带基本一致且清晰，其中循环为38时，扩增出的条带最为清晰；当循环次数为40时，扩增条带较粗，不利于后期读带分析。因此，ISSR-PCR扩增反应程序的最佳循环次数为38。

2.6 引物退火温度的优化

利用优化的ISSR-PCR反应体系，从50个ISSR引物中筛选出了14个引物，并根据引物的Tm值设定了不同的退火温度，经电泳检测（图6），最后确定了各引物的最佳退火温度（表2）。

3 小结与讨论

本试验首先采用正交试验确定模板DNA用量和引物浓度之间的关系，确定较好反应体系，再采用单因子试验对各因素进行优化，然后利用优化的反应体系进一步对PCR循环次数和引物的退火温度进行筛选，最终得到一个最优的ISSR-PCR反应扩增体系：15 μL反应体系中含有7.5 μL 2×Taq PCR Plus Master Mix，DNA模版40 ng、引物终浓度0.7 μmol/L、最后用RNase-Free Water补足剩余部分。扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，最佳退火温度退火30 s，72 ℃延伸90 s，38个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

ISSR-PCR反应包含多种因素，各个因素的变化都会对试验结果产生影响[14]。采用正交试验可以分析不同因素间的相互作用，但各个因子水平梯度设置有限，不利于找到该因素的最佳用量；而单因子试验设置较精确的梯度确定各因素的用量，但对各个因素间影响无法确定，因此本研究采用正交试验和单因子试验相结合的方法来构建ISSR-PCR的反应体系。本试验得到的DNA模板用量和引物浓度与王书珍等[15]报道的杜鹃花ISSR-PCR反应体系相吻合。在一些研究报道中，用到ISSR引物退火温度大多在52～56 ℃之间[16]，而本试验结果表明，有些引物的退火温度最高达到59.9 ℃，最低只有46.3 ℃。因此，在进行ISSR试验前，根据ISSR引物序列的碱基构成进行相应的退火温度设计和优化是十分必要的。

本研究建立了优化的对节白蜡ISSR-PCR反应扩增体系，并利用该反应体系筛选出了14条多态性高、稳定性强的引物，而且确定了各引物的退火温度，该结果为后期进一步开展对节白蜡在分子生物学方面的研究奠定了基础。

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