长白山胡桃楸种仁壳多糖提取工艺的优化

李胜男++赵起越++付刚++沙迪++徐红艳

摘要：为确定胡桃楸（Juglans mandshurica）种仁壳多糖提取工艺条件，以多糖提取量为考察指标，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。在单因素试验基础上，选取提取温度、提取时间、料液比为自变量，多糖提取量为响应值，采用响应面法对种仁壳多糖提取工艺进行优化。结果表明，各变量影响主次顺序为提取时间>料液比>提取温度，优化后的最佳提取工艺条件为提取温度82 ℃，提取时间3.7 h，料液比1∶45（g∶mL）。通过验证试验，胡桃楸种仁壳多糖提取量为8.64 mg/g，RSD为1.94%，该回归方程与实际情况拟合较好。

关键词：胡桃楸（Juglans mandshurica）；种仁壳；多糖；响应面法

中图分类号：S792.132；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）22-5907-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.045

Optimization of Extract Technology of Polysaccharides from Seed Shell of

Juglans mandshurica in Changbai Mountain

LI Sheng-nan，ZHAO Qi-yue，FU Gang，SHA Di，XU Hong-yan

（Agricultural College of Yanbian University， Yanji 133002， Jilin， China）

Abstract：In order to determine the optimal conditions of polysaccharides extraction from seed shell of Juglans mandshurica， the content of polysaccharides was measured by the method of phenol-sulphate acid with the extraction yield of polysaccharides as evaluation index. Based on the single factor test，the extraction temperature，extraction time and solid-to-liquid ratio were selected as independent variables，and the extraction yield of polysaccharides was as response value，the extraction technology of polysaccharides from seed shell was optimized by response surface methodology（RSM）. Results showed that，the variables were ranked in decreasing order as extraction time，solid-to-liquid ratio and extraction temperature. The optimized extraction conditions were found to be a extraction temperature of 82 ℃，extraction time of 3.7 h and a solid-to-liquid ratio of 1∶45（g/mL）. The validation experiments indicated that，the extraction yield of polysaccharides from seed shell of Juglans mandshurica was 8.64 mg/g with RSD of 1.94%（n=5），and the experimental data could be well fitted with the developed regression equation.

Key words： Juglans mandshurica； seed shell； polysaccharides； response surface methodology

胡桃楸（Juglans mandshurica）又名山核桃、楸樹，为胡桃科胡桃属落叶乔木，在东北分布广泛，主要集中在小兴安岭、长白山区、完达山脉及辽宁东部，在大兴安岭林区东南部有少量分布[1]，是珍贵的用材树种，也是重要的药源植物，其叶、树皮、根及果实均可入药[2]。胡核楸属伴生树种[3]，与水曲柳、黄菠萝并称“东北三大硬阔”，是国家Ⅱ级珍稀树种和中国珍稀濒危树种的三级保护植物[4，5]。胡桃楸种子是林业副产品，其种仁（俗称山核桃仁）营养价值很高，早已成为人们的食疗佳品。在种仁生产过程中，产生大量的种仁壳废弃物，造成了资源的浪费。有研究显示，胡桃楸种仁壳中含有多种化学成分，包括氨基酸、多糖、皂甙、黄酮、挥发油、香豆素类等[6]。现代研究证实胡桃楸具有抗氧化、抗肿瘤、镇痛、抗炎和杀菌等生物活性[7，8]。而目前对胡桃楸种子的研究主要集中在种仁的营养成分和营养价值以及在食品工业中的应用等方面[9]，关于胡桃楸种仁壳的相关研究仅限于本课题组前期的种仁壳中黄酮成分的相关研究[10-13]，而有关胡桃楸种仁壳多糖的相关研究未见报道。

多糖（Polysaccharides，PS）又称多聚糖，是由10个以上的单糖分子通过苷键聚合而成，一般由几百甚至几万个单糖分子组成，是一类大分子化合物[14]。多糖广泛存在于动物细胞膜、高等植物和微生物细胞壁中，从量上讲，是碳水化合物在自然界中存在的主要形式[15]。随着医学、生物学和高分子科学的不断发展和相互渗透，发现多糖具有免疫调节、抗菌、抗炎、抗病毒等多种生物功能，具有高效低毒的特点，是中药的主要活性成分之一，并已在临床上得到广泛应用[16，17]。

本研究以加工胡桃楸种仁产生的废弃物种仁壳为原料，在单因素试验的基础上，采用响应面法优化胡桃楸种仁壳多糖的提取条件，旨在为胡桃楸种仁壳多糖的深入研究提供理论依据，从而提高胡桃楸种子的附加值，促进其综合开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

胡桃楸种子采摘于吉林省延边朝鲜族自治洲和龙市南岗山林区。无水葡萄糖、5%苯酚溶液、浓硫酸均为分析纯。

UV-1800型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；HH-S6型恒温水浴锅（余姚市肖东仪表厂）；BSA124S-CW型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程 胡桃楸种仁壳→去除杂质、粉碎→过筛→水浴浸提→定容→苯酚硫酸法显色→测定多糖含量。

1.2.2 标准曲线的绘制 采用苯酚-硫酸法[18]，精确称取105 ℃真空干燥至恒重的无水葡萄糖标准品24.0 mg，置于100 mL容量瓶中，配制0.24 mg/mL的葡萄糖标准品储备液。精确移取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL标准品储备液于试管中，再分别加入2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2 mL蒸馏水。然后再依次加入1.0 mL 5%苯酚溶液，摇匀，慢慢加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后置于40 ℃水浴15 min，取出置于冷水中冷却10 min，蒸馏水做空白，486 nm处测吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标得出标准曲线回归方程。

1.2.3 胡桃楸种仁壳多糖的提取 准确称取胡桃楸种仁壳粉末0.5 g，按适当料液比加入蒸馏水，置于恒温水浴中加热，过滤，滤液于100 mL容量瓶中定容，备用。吸取定容提取液3 mL，按绘制标准曲线方法测定吸光度，多糖提取量按如下公式计算：

多糖提取量=C×V/m

式中，C为按标准曲线计算的提取液多糖质量浓度（μg/mL）；V为液体体积（mL）；m为原料质量（g）。

1.2.4 单因素试验 以多糖提取量为指标，以提取料液比、提取温度、提取时间为单因素，进行胡桃楸种仁壳多糖提取的单因素试验。

1.2.5 响应面优化试验设计 根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用3因素3水平响应面分析法。在单因素试验的基础上，以液料比（g∶mL，下同）、提取温度、提取时间3个因素为自变量，以多糖提取量为响应值，采用最小二乘法拟合二次多项方程表达响应值，试验因素编码及水平见表1。采用Minitab15软件进行试验方案设计与结果统计分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程y=0.012 9x+0.017 5，R2=0.991 7，表明葡萄糖在0.017 5～0.800 0 mg/mL吸光度与浓度之间存在良好的线性关系。

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对胡桃楸种仁壳多糖的影响 按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，恒温80 ℃提取1 h，考察不同料液比对多糖提取量的影响，结果见图1。由图1可知，随着溶剂的增加，多糖提取量逐渐增加，当料液比大于1∶40时，增加幅度较大，之后呈现缓慢增长的趋势。故选1∶40为最佳提取料液比。

2.2.2 温度对胡桃楸种仁壳多糖的影响 按料液比1∶30，分别在50、60、70、80和90 ℃条件下，提取3 h，考察提取温度对多糖提取量的影响，结果见图2。温度升高，分子运动速度加快，渗透、扩散速度也加快。如图2所示，随着提取温度的增加，多糖提取量不断增大。但考虑温度过高时，其他非多糖类的杂质溶出量也会相应增大。因此确定最佳温度为80 ℃。

2.2.3 时间对胡桃楸种仁壳多糖的影响 在料液比1∶30，80 ℃条件下，分别提取1、2、3、4、5 h，考察提取时间对多糖提取量的影响，结果见图3。由图3可知，随着提取时间的延长，多糖提取量也逐渐增加，当提取时间大于3 h，多糖提取量呈现缓慢增长的趋势。因此确定最佳提取时间为3 h。

2.3 响应面试验结果

根据Box-Behnken试验原理，按表2进行试验，对试验结果进行二次多项式逐步回归拟合，得到如下回归模型：

Y=8.304 50+0.477 85X1+0.212 54X2+0.666 46X3-0.423 72X12-0.960 25X22-0.628 65X32+0.610 47X1X2+0.134 37X1X3+0.051 50X2X3

模型的可靠性可以從方差分析及相关系数来考察，采用Minitab15软件进行模型的系数检验和方差分析，结果见表3和表4。由表3可知，一次项X1对多糖提取量影响显著（P<0.05），X3对多糖提取量影响极显著（P<0.01）；二次项X22和X32对多糖提取量影响显著（P<0.05）；交互项X1X2对多糖提取量影响显著（P<0.05）。模型的相关系数R2=0.920 1。由表4可知，对胡桃楸种仁壳多糖提取所建立的二次多项模型回归项P值为0.027，具有显著性（P<0.05）；模型失拟项P值为0.655，不显著（P>0.05）。因此，该模型拟合度较好，可以用此模型对胡桃楸种仁壳多糖提取进行分析和预测。

图4～图6分别为料液比、提取温度、提取时间3因素影响胡桃楸种仁壳多糖提取量的响应面和等高线。综合分析响应面试验结果，提取时间对胡桃楸种仁壳多糖提取量影响最大，其次是料液比，影响最小的是提取温度。依据回归方程，响应面优化的胡桃楸种仁壳多糖的最佳提取工艺参数为：料液比1∶44.78，提取温度82.13 ℃，提取时间3.67 h，回归模型预测的山核桃壳多糖提取量理论值为8.83 mg/g。结合实际操作，最终确定最佳提取工艺参数为提取温度82 ℃，提取时间3.7 h，料液比1∶45。按照最终确定的最佳工艺参数（提取温度82 ℃，提取时间 3.7 h，料液比1∶45）进行5次平行试验，多糖平均提取量为8.64 mg/g，与理论预测值8.83 mg/g相比，相对标准偏差为1.94%，可见该模型能较好地模拟和预测胡桃楸种仁壳多糖的提取效果。

3 结论

本研究以长白山胡桃楸种仁壳为原料，在单因素试验基础上，采用响应面法对胡桃楸种仁壳多糖的恒温水浴提取工艺进行了优化。结果表明，最佳提取工艺条件为提取温度82 ℃，时间3.7 h，料液比1∶45，各因素对多糖提取量影响的主次顺序是：提取时间>料液比>提取温度。经验证试验，胡桃楸种仁壳多糖提取量为8.64 mg/g，与理论预测值之间的相对偏差较小，表明经响应面法优化的种仁壳多糖的提取条件是真实可靠的。长白山胡桃楸种仁壳可以作为植物多糖的可开发利用资源，但关于种仁壳多糖的纯化、单糖组成分析及活性作用还有待进一步的研究。

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