熟地平颤颗粒对帕金森病大鼠行为学及α-突触核蛋白表达的影响

叶 青，王 凯，袁晓蕾，何 静，周 洁，袁灿兴

熟地平颤颗粒对帕金森病大鼠行为学及α-突触核蛋白表达的影响

叶 青1，王 凯2，袁晓蕾1，何 静1，周 洁1，袁灿兴1

目的 观察熟地平颤颗粒对帕金森病大鼠行为学及黑质内α-突触核蛋白(α-syn)表达的影响。方法 采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)注射于大鼠脑右侧黑质造成偏侧帕金森病(PD)模型。实验设立正常对照组、帕金森病模型组、左旋多巴(LD)组、LD+中药(TCM)组，治疗4周后观察各组大鼠旋转圈数、旋转持续时间以及异常不自主运动(AIM)评分的变化；采用RT-PCR方法检测大鼠黑质内α-syn基因表达情况；免疫组织化学法检测黑质内α-syn、TH蛋白的表达情况。结果 与治疗前比较，PD组大鼠旋转圈数差异无统计学意义(P>0.05)，旋转持续时间较治疗前缩短(P<0.05)。与同期PD组比较，LD组第7天、第14天的旋转圈数旋转持续时间均低于PD组，第28天的评分高于PD组(P<0.05)；与同期LD组比较，LD+TCM组自第21天起的旋转圈数、旋转持续时间评分显著降低(P<0.05)。LD组大鼠用药后第14天起的AIM评分逐步增高(P<0.01)；LD+TCM组治疗前后AIM评分差异无统计学意义。PD组与正常对照组比较α-synmRNA表达增高，Levodopa组与PD组比较，α-synmRNA明显增高，LD+TCM组较LD组α-synmRNA表达显著降低(P<0.05)。免疫组化结果显示：PD组较正常对照组α-syn表达增加sTH表达降低；LD组与PD组比较，α-syn表达增加sTH表达降低；LD+TCM组与LD组比较，α-syn表达降低sTH表达增加(P<0.01)。结论 长期使用左旋多巴可以引起α-syn过表达，进一步加重中脑黑质区的神经损伤，造成行为学症状恶化。熟地平颤颗粒结合左旋多巴治疗PD有明显的增效减毒作用，中药通过抑制α-syn的过表达，减少了黑质多巴胺能细胞的损伤，有效缓解了帕金森病症状。

帕金森病；熟地平颤颗粒；行为学；α-突触核蛋白；增效减毒

帕金森病是一种以黑质多巴胺能神经元变性缺失为病理特点的神经退行性疾病，帕金森病(Parkinson’s disease，PD)最主要的病理学特征是黑质多巴胺能神经元内路易小体(其主要成分是错误折叠的α-突触核蛋白)形成[1]。左旋多巴(levodopa，LD)替代疗法可明显减轻PD病人的临床症状，但在长期应用左旋多巴的过程中，异动症和症状波动等运动并发症不可避免[2]，这些并发症的产生可能与左旋多巴激活α-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)过表达有关[3]，过表达的α-syn可促使α-syn形成寡聚体，已有较多的研究证实α-syn寡聚体等中间体和原纤维具有神经毒性作用，导致神经细胞凋亡[4]。为解决左旋多巴治疗的缺陷，预防并发症的发生，本实验观察熟地平颤颗粒联合左旋多巴对PD大鼠行为学以及α-syn表达的影响，探讨中药是否通过抑制α-syn的过表达从而发挥神经保护作用，为今后制定有效的PD防治策略提供线索。

1 材料与方法

1.1 实验药物 熟地平颤颗粒由熟地黄、桑寄生、天麻、僵蚕、葛根、莪术、丹参、天南星、全蝎、蜈蚣组成，由江阴天江药业有限公司制成颗粒剂(批号：1410302)。取熟地平颤颗粒19.2 g(相当于成人1 d用量，含生药128 g)混合后溶于100 mL生理盐水中，使每毫升含生药1.28 g。LD粉剂5 g(批号：SLD6382)和苄丝肼粉剂5 g(批号：SL06492)，由美国Sigma公司提供。

1.2 实验动物 SPF级雄性SD大鼠72只，体重180 g～200 g，由上海中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号为SCXK沪2015-0015。

1.3 主要试剂和仪器 Benserazide hydrochloride，Levodopa，6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)、阿扑吗啡(apomorphine，APO)、5%天竹牡丹，美国Sigma公司产品；Anti-TYH/TH，Rabbit anti-p-ERK1/2，Rabbit anti-Bax，Rabbit anti-Bcl-2(Ser63，Cell Signaling Technology，USA)，TUNEL试剂盒(Roche公司)。SR-6N 型大鼠脑立体定位仪，日本Narishige；Leica组织切片机RM2235，北京中显鼎盛科技有限公司；Nikon照相机D7000、Nikon显微镜E100，尼康仪器(上海)有限公司；冷冻离心机AllegraX-15R，美国Beckman公司。PMR + Q550 病理图像分析仪，德国Leica公司。

1.4 实验方法

1.4.1 PD大鼠模型制备[5]雄性SD大鼠60只，麻醉后固定于大鼠脑立体定向仪上，参照包新民等[6]编著的大鼠脑立体定位图谱，采用两点法造模，黑质致密部(SNC)：前囟后4.8 mm，矢状缝右侧2.0 mm；硬膜下8.0 mm；中脑腹侧被盖区(VTA)：前囟后4.8 mm，矢状缝右侧1.2 mm，硬膜下8.2 mm。牙科钻打孔，向两坐标点各注射6-OHDA 6 μg注射速度为1 μL/min，留针10 min。术后14 d应用阿扑吗啡腹腔注射(0.5 mg/kg)，若大鼠恒定转向左侧且旋转圈数>7圈/min则视为成功帕金森病模型[7]。正常对照组大鼠模型制备：雄性SD大鼠12只，用上述同样方法向右侧SNC和VTA分别注射6 μL生理盐水。

1.4.2 动物分组及给药 60只大鼠造模后经行为学测试，成功造模的PD模型大鼠36只，随机分为帕金森病模型组、左旋多巴组、左旋多巴+中药组，每组12只，另取12只生理盐水造模大鼠为正常对照组。左旋多巴组予以左旋多巴/苄丝肼治疗(20 mg/kg左旋多巴和2.5 mg/mL苄丝肼溶于含0.05%乙醇和0.1%抗坏血酸的消毒生理盐水中)，每日20 mg/kg，每日2次腹腔注射；左旋多巴+中药组在左旋多巴组基础上给予中药灌胃，每次灌胃量为7.5 mL/kg，每日2次；帕金森病模型组及正常对照组给予相同剂量的生理盐水灌胃及生理盐水腹腔注射，疗程为4周。本实验获得了上海中医药大学实验动物伦理委员会的批准(批准号：No.09047)。

1.4.3 行为学测试方法

1.4.3.1 APO诱导大鼠对侧旋转行为的评定 3组大鼠均腹腔注射APO 0.5 mg/kg以诱发大鼠向对侧旋转，用钟式测转仪测量旋转次数。记录开始旋转至30 min内总的旋转圈数及旋转持续时间[8]。每7 d观察1次。

1.4.3.2 异常不自主运动(abnormal involuntary movement，AIM)评分测定 左旋多巴组、左旋多巴+中药组大鼠，每周1次进行AIM评分[9]，腹腔注射左旋多巴/苄丝肼后立即评分，每30 min评定1次，持续120 min。将AIM分为4个部分(前肢、口面部、轴性及运动)进行评定，每部分又根据其有或无及严重程度划分为五个等级(0分～4分)，其中0分：无；1分：偶尔出现；2分：经常出现；3分：持续存在，刺激使之停止；4分：持续存在，刺激也不能使之停止。理论上1只大鼠1次用药后的AIM最高评分为64分。

1.4.4 免疫组化检测黑质内α-syn、TH的蛋白表达变化[10]在末次给药2 h后，每组取6只大鼠用10%水合氯醛麻醉，麻醉后用4%多聚甲醛经心脏灌流，取出脑组织后置于同一固定液中后固定12 h，取中脑黑质脑段经脱水、浸蜡、包埋等步骤制成石蜡块，石蜡块切片，片厚5 μm。取上述脑组织切片经脱蜡至水，微波修复抗原后，分别滴加3%过氧化氢和正常山羊血清封闭抗原，滴加一抗(兔抗大鼠α-syn、TH多克隆抗体)，4 ℃过夜，滴加生物素化山羊抗兔IgG 37 ℃ 30 min，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。显微镜下观察以细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性信号。随机采集10个高倍镜视野，HMIAS-2000 高清晰彩色病理图像分析系统进行图像分析检测阳性细胞内表达产物的平均光密度值(OD) 和灰度值，对α-syn、TH表达产物进行半定量分析。

1.4.5 Real-time PCR检测大鼠黑质α-syn mRNA表达

1.4.5.1 大鼠脑组织抽提RNA及反转录反应 取大鼠纹状体组织50 mg，加入1 mL Trizol液，充分匀浆，22 ℃，静置5 min，加入氯仿0.2 mL，颠倒15 s，22 ℃，静置3 min，4 ℃，14 000 r/min离心15 min，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL异丙醇，混匀，22 ℃，静置10 min，：4 ℃，14 000 r/min离心10 min，弃上液，加入1 mL 4 ℃ 75%乙醇， 4 ℃×10 000 r/min离心5 min，弃上液，真空干燥5 min，用40 μL DEPC处理水溶解，-80 ℃保存。引物序列：Rat-α-synuclein-F(gaagacagtggagggagctg)，Rat-α-synuclein-R(ttccaggattccctcttgtg)，产物长度106；PCR反应条件为95 ℃ 30 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

1.4.5.2 RT-PCR数据换算方法 目的基因的相对表达量可以采用∆∆CT法加以分析。通常以正常或阴性作为对照样本。CT值—n：扩增循环∆CT=目的基因CT-内参CT (注：同一反转录产物扩增后)；∆∆CT=观察样本∆CT-对照样本∆CT=(观察样本目的基因CT-观察样本内参CT)-(对照样本目的基因CT-对照样本内参CT)样本的相对表达量=2-∆∆CT。

1.5 统计方法

1.5.1 行为学统计 使用重复测量数据多重比较配对的t检验法(Bonferroni法)，可进行每个分组每个时间点上作用的两两比较；使用多元方差分析的方法，可进行每个时间点上每个分组之间作用的两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠旋转圈数比较 与治疗前(第0天)比较，PD组大鼠旋转圈数各期差异无统计学意义(P>0.05)；LD组用药后第7天、第14天、第21天的旋转圈数低于治疗前(P<0.01)，第28天评分显著高于治疗前(P<0.05)；LD+TCM组用药后各期的旋转圈数逐步降低(P<0.01)。与同期PD组比较，LD组第7天、第14天、第21天的旋转圈数低于PD组(P<0.01)，第28天的旋转圈数高于PD组(P<0.05)；LD +TCM组自第7天起的旋转圈数显著低于同期PD组(P<0.01)。LD +TCM组第7天、第14天、第21天、第28天的旋转圈数较同期LD组显著降低(P<0.05)。详见图1。

注：与第0天比较，*P<0.05，**P<0.01；与PD 组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与LD组比较，#P<0.05，##P<0.01。

图1 各组大鼠旋转圈数比较

2.2 各组大鼠旋转持续时间比较 与治疗前(第0天)比较，PD组大鼠第28天旋转持续时间较治疗前降低(P<0.05)；LD组用药后第7天、第14天的旋转持续时间降低(P<0.05)，第21天开始升高，至第28天评分显著高于治疗前(P<0.05)；LD+TCM组用药后各期的旋转持续时间逐步降低(P<0.05)。与同期PD组比较，LD组第7天、第14天的旋转持续时间低于PD组，第28天的评分高于PD组；LD +TCM组自第7天起的旋转持续时间低于同期PD组(P<0.01)。LD +TCM组第7天、第14天的旋转持续时间较同期LD组显著降低(P<0.01)。详见图2。

注：与第0天比较，*P<0.05，**P<0.01；与PD 组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与LD组比较，#P<0.05，##P<0.01。

图2 各组大鼠旋转持续时间比较

2.3 两组大鼠AIM评分比较 与治疗第7天比较，LD组大鼠用药后第14天、第21和第28天的AIM评分逐步增高(P<0.01)，第21天起AIM评分>20分，出现异动症；LD+TCM组仅用药后第21天评分较第7天升高(P<0.05)，其余各期均无差异。与同期LD组比较，LD +TCM组大鼠自第7天起的AIM评分值低于同期LD组(P<0.05)。详见图3。

注：与第7天比较，*P<0.05，**P<0.01；与LD组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

2.4 各组大鼠中脑黑质区α-syn、TH表达比较 α-syn免疫组化染色结果显示，各组与正常对照组比较，α-syn表达明显增加(P<0.01)；LD组较PD组α-syn表达明显增加(P<0.01)；LD +TCM组α-syn表达数较之LD组明显下调(P<0.01)。TH免疫组化染色结果显示，各组与正常对照组比较，TH表达明显减少(P<0.01)；LD组较PD组TH表达明显减少(P<0.01)；LD+TCM组TH表达数较之LD组明显增加(P<0.01)。详见表1、图4、图5。

表1 各组大鼠中脑黑质区α-syn、TH表达比较(±s)

注：①为正常对照组；②为PD组；③为LD组；④为LD+TCM组

注：①为正常对照组；②为PD组；③为LD组；④为LD+TCM组。

2.5 各组大鼠中脑黑质区α-syn mRNA表达比较 与正常对照组比较，PD组、LD组大鼠中脑黑质区α-syn mRNA表达增高；与PD组比较，LD组α-syn mRNA表达明显增高(P<0.05)。与LD组比较，LD+TCM组α-syn mRNA表达明显降低(P<0.05)。详见图6。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与LD组比较，△P<0.05。

图6 各组大鼠中脑黑质区α-syn mRNA表达结果

3 讨 论

帕金森病是一种常见于中老年人的神经退行性疾病，以选择性中脑黑质多巴胺能神经元丧失、纹状体多巴胺含量显著减少为特征[11]。目前，PD的治疗主要为以左旋多巴制剂为主的替代疗法，但该方法仅能缓解临床症状，并不能阻止或延缓 PD的进程[12]，同时长期使用该法也存在疗效衰减及运动障碍等副作用，严重影响病人生存质量[13]。因此，阻止或减缓黑质多巴胺能神经元的进行性变性，减少左旋多巴制剂毒副作用对延缓病情的进展具有重要的意义。

PD的发病原因至今不明，主要病理改变为中脑黑质致密部的多巴胺能神经元的进行性丢失及神经元胞质中出现大量以α-syn为主要成分的路易小体和路易轴突[14]。最新研究发现过表达的α-syn可促使α-syn的蛋白结构由α螺旋变换为β折叠二级结构，后者具有很强的聚合倾向[15]。α-syn寡聚体等中间体和原纤维具有神经毒性作用，寡聚体可与突触囊泡结合并产生小孔，增加囊泡的通透性，引起钙离子内流、多巴胺外漏以及线粒体膜去极化，致使神经元死亡[16]。所以，开发维持α-syn正常构象的药物，防止其发生错误折叠和聚集，就可以达到阻止疾病进展的目的。中医药虽然不能彻底治愈PD，但长期临床应用中发现熟地平颤方在改善运动症状尤其是非运动症状方面疗效显著，与左旋多巴合用能明显延缓帕金森病的进展[17]。

我们在长期的临床实践中，以滋补肝肾、通络解毒立法，形成熟地平颤方，药物选用熟地、枸杞、桑寄生、白芍、天麻、僵蚕、莪术、生南星、全蝎、蜈蚣。诸药合用，共奏滋补肝肾，搜风解毒，通络散结之功。前期实验证实了熟地平颤颗粒通过抑制ERK通路的过度激活、调控突触后多巴胺D1、D2受体介导的直接、间接通路之间的失衡状态，从而减轻了PD大鼠的异动症症状。本次试验发现长期左旋多巴治疗会导致PD大鼠黑质内α-syn的过表达，引起TH的进一步减少，导致行为学症状恶化。熟地平颤颗粒能够明显抑制黑质内α-syn的过表达状态，减少了黑质多巴胺能细胞的损伤，有效缓解了帕金森病症状。

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(本文编辑郭怀印)

Effects of Shudi Pingchan Granule on Behavior and α-synuclein Expression in Rats with Parkinson’s Disease

Ye Qing，Wang Kai，Yuan Xiaolei，He Jing，Zhou Jie，Yuan Canxing

Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China Corresponding Author：Yuan Canxing

Objective To observe the effect of Shudi Pingchan granule (SPG) on behavior and α-synuclein (α-syn) expression in substantia nigra in rats with Parkinson’s disease (PD). Methods The rat model of hemiparkinsonian was established by injecting 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into substantia nigra of right brain. Then，the rats were divided into normal control group，PD group，levodopa (LD) group，and LD plus SPG group. After 4 weeks of treatment，the number of turns，total duration of turning and abnormal involuntary movement (AIM) scores were observed. The gene expression of α-synuclein was detected by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The protein expression of α-syn and TH was detected by immunohistochemistry. Results The number of turns in PD group had no significant difference compared with that before treatment(P>0.05)，and total duration of turning shortened (P<0.05).The total duration of turning in LD group on the 7th and 14th day were lower than those in PD group in the same time，but they were higher than those in PD group on the 28th day(P<0.05). The number of turns and total duration of turning in LD+TCM group was significantly lower than those of PD group since the 14th day(P<0.05). The AIMs of LD group increased graduallysince the 14th day(P<0.01). The scores of AIM in LD plus SPG group had no difference compared with that before treatment(P>0.05). Compared with normal control group，α-syn mRNA expression increased significantly in PD group.Compared with PD group，α-syn mRNA significantly increased in LD group. The expression of α-syn mRNA in LD plus SPG group decreased obviously compared with LD group (P<0.05). Compared with the normal control group，α-syn expression increased and TH expression reduced in PD group. Compared with PD group，α-syn expression increased and TH expression decreased in LD group. Compared with LD group，α-syn expression decreased and TH expression increased in LD plus SPG group (P<0.01).Conclusion Long-term use of LD can cause over-expression of α-syn and further aggravatenerve damage in midbrain nigra，which makes the behavioral symptoms worse. SPG and LD treating PD has effect on apparente synergia and attenuation. SPG can effectively alleviate the symptoms of PD by inhibiting over-expression of α-syn，reducing the damage of dopaminergic cells.

Parkinson’s disease；Shudi Pingchan granule；behavior；α-synuclein；apparente synergia and attenuation

国家自然科学基金面上项目(No.81673726)；国家自然科学基金青年项目(No.81302926)；上海市科委重大项目(No.15401970100)；上海市卫计委杏林新星人才计划项目(No.ZY3-RCPY-2-2005)

1.上海中医药大学附属龙华医院(上海 200032)；2.上海中医药大学

袁灿兴，E-mail：ycanxing@hotmail.com

R541.7 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.04.009

1672-1349(2017)04-0419-06

2016-10-16)

引用信息：叶青，王凯，袁晓蕾，等.熟地平颤颗粒对帕金森病大鼠行为学及α-突触核蛋白表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(4)：419-424.