自噬及PI3K-Akt通路在舒芬太尼后处理心肌缺血再灌注损伤保护中的作用

王智华，田首元，王建刚，贺 萱，朱 健

自噬及PI3K-Akt通路在舒芬太尼后处理心肌缺血再灌注损伤保护中的作用

王智华1，田首元2，王建刚2，贺 萱1，朱 健2

目的 探讨自噬及PI3K-Akt通路在舒芬太尼后处理心肌缺血再灌注损伤保护中的作用。方法 选用雄性SD大鼠(220 g～260 g)35只，随机分为5组：假手术组(S组)、心肌缺血再灌注损伤组(I/R组)、舒芬太尼后处理组(SP组)、舒芬太尼后处理+PI3K-Akt通路的抑制剂Wortmannin组(SP+W组)、Wortmannin组(W组)。I/R组、SP组、SP+W组以及W组采用结扎冠脉左前降支(LAD)30 min、再灌注120 min的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型。S组在冠脉左前降支(LAD)下穿线但不结扎。于再灌注前5 min，I/R组由股静脉给予生理盐水1 mL，SP组给予舒芬太尼(1 μg/kg)，SP+W组给予舒芬太尼(1 μg/kg)及Wortmannin(15 μg/kg)，W组给予Wortmannin(15 μg/kg)。再灌注120 min时腹主动脉取血，检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)的浓度；处死大鼠后，取心尖组织，Western blot法检测Akt、磷酸化的Akt(p-Akt)、LC3-Ⅱ的表达；电镜下观察自噬体的生成情况。结果 与S组比较，I/R组、SP组、SP+W组及W组CK-MB含量、LC3-Ⅱ表达增加，p-Akt/Akt升高，差异有统计学意义(P<0.05)，自噬体数量增多；与I/R组比较，SP组CK-MB含量、LC3-Ⅱ表达减少，p-Akt/Akt升高，差异有统计学意义(P<0.05)，自噬体数量减少；与SP组比较，SP+W组、W组CK-MB含量、LC3-Ⅱ表达增加，p-Akt/Akt降低，差异有统计学意义(P<0.05)，自噬体数量增多。结论 舒芬太尼后处理可能通过抑制自噬水平而在心肌缺血再灌注损伤中起到保护作用，其中PI3K-Akt通路可能是主要通路之一。

心肌缺血；再灌注损伤；自噬；舒芬太尼；PI3K-Akt通路

大量实验已经表明缺血后处理可以减轻心肌缺血再灌注损伤[1]。前期研究表明：舒芬太尼后处理可以起到心肌缺血再灌注损伤保护作用，且与PI3K-Akt通路有关[2]。同时亦有研究表明在缺血再灌注损伤中，自噬过度表达是心肌再灌注损伤的因素之一[3]，而PI3K-Akt通路是自噬调控的一条经典通路[4]，本研究尝试探讨舒芬太尼后处理是否通过抑制自噬产生保护作用，同时探讨PI3K-Akt通路在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性SD大鼠35只(SPF级)，220 g～260 g，购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。35只SD大鼠采用随机数字表法随机分为5组：假手术组(S组)、缺血再灌注损伤组(I/R组)、舒芬太尼(宜昌人福药业有限责任公司，批号1150316)后处理组(SP组)、舒芬太尼后处理+PI3K-Akt通路的抑制剂渥曼青霉素(Wortmannin，山西普兴生化工程有限公司，批号20150503)组(SP+W组)、Wortmannin组(W组)。

1.2 方法

1.2.1 实验模型制备 实验前大鼠禁食8 h以上，自由饮水，20%乌拉坦(5 mg/kg)腹腔注射麻醉。大鼠麻醉后，将大鼠腹部朝上，四肢固定，在其皮下插入电极，连接心电图机，观察记录正常Ⅱ导联心电图。然后颈部正中作气管切开，插入导管后固定，连接动物呼吸机人工通气(设置潮气量3 mL/100 g，频率70次/min)。于左胸壁心脏搏动最明显处开胸，在心脏表面寻找左冠状动脉前降支(LAD)，不明显则选择左耳根部下方2 mm处定位，以6-0带针线穿过心肌表层，在肺动脉圆锥旁出针，活结结扎LAD，造成心前区缺血，以LAD供血区颜色青紫或苍白色、心电图ST段抬高作为缺血标准。缺血30 min后，松开结扎线，再灌注120 min，以缺血区颜色变红，心电图ST段恢复基础水平或降低明显作为标准。

1.2.2 实验分组处理 S组于LAD下方穿线，不结扎；再灌注前5 min；I/R组由股静脉给予生理盐水1 mL；SP组给予舒芬太尼稀释液1 mL(1 μg/kg)，SP+W组给予舒芬太尼稀释液(1 μg/kg)及Wortmannin稀释液(15 μg/kg)共1 mL，W组给予Wortmannin稀释液(15 μg/kg)1 mL。

1.2.3 心肌Akt、p-Akt、LC3-Ⅱ蛋白表达测定 各组分别取4只大鼠，再灌注120 min时腹主动脉取血，然后处死大鼠，剪取缺血心尖心肌组织，生理盐水冲洗血液。将部分缺血心尖心肌组织剪碎，按组织重量(100 mg)加入RIPA裂解液1 mL、10 μL苯甲基磺酰氟(PMSF，蛋白酶抑制剂)、10 μL广谱磷酸酶抑制剂，置于4 ℃冰箱3 h后离心(13 000 r/min，15 min)，取上层清液，采用BCA法测定蛋白浓度(裂解相关试剂及BCA蛋白定量试剂盒均购于武汉博士德生物有限公司)。依据测定的蛋白含量结果，加入蛋白及缓冲液，煮沸5 min，蛋白变性后，在12%分离胶/5%集成胶上进行电泳，在电转仪(15 V，15 min)上将凝胶上的蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后用5%牛血清蛋白在4 ℃下封闭2 h。封闭后洗膜，然后加入兔抗鼠Akt单克隆抗体(稀释度1∶7 500，ABCAM公司，批号ab32505)、兔抗鼠p-Akt单克隆抗体(稀释度1∶5 500，ABCAM公司，批号ab108266)和兔抗鼠单克隆LC3-Ⅱ(稀释度1∶1 000，CST公司，批号3868S)，4 ℃下孵育过夜，孵育完成后洗膜，加入羊抗兔二抗(稀释度1：3 500，博士德生物工程有限公司，批号BA1054)，反应2 h后显影曝光，以目标蛋白条带与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)灰度值得比值反映Akt、p-Akt和LC3-Ⅱ的表达水平。

1.2.4 心肌损伤标记物肌酸激酶同工酶(CK-MB)测定 腹主动脉取血后离心，取上层血清，ELISA法检测血清中CK-MB的含量，评估心肌损伤情况。

1.2.5 自噬小体观测 将另一部分心尖心肌组织剪成1 mm3大小，置于固定液中，制片后观察自噬小体生成情况。

2 结 果

2.1 血清CK-MB比较 与S组比较，I/R组、SP组、

SP+W组、W组血清CK-MB增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与I/R组相比较，SP组CK-MB降低，差异有统计学意义(P<0.05)，SP+W组、W组CK-MB与I/R组差异无统计学意义(P>0.05)；与SP组相比较，SP+W组、W组CK-MB增多，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

2.2 心肌细胞Akt、p-Akt以及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达 与S组比较，I/R组、SP组、SP+W组、W组p-Akt/Akt增高，LC3-Ⅱ表达增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与I/R组比较，SP组p-Akt/Akt增高，LC3-Ⅱ表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)，SP+W组、W组差异无统计学意义；与SP组比较，SP+W组、W组p-Akt/Akt降低，LC3-Ⅱ表达增多，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图1。

图1 心肌细胞Akt、p-Akt以及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达

组别nCK⁃MB(pg/mL)Aktp⁃Aktp⁃Akt/AktLC3⁃ⅡS组70．330±0．0560．805±0．0110．301±0．0140．374±0．016 0．398±0．050 I/R组71．178±0．0540．821±0．0120．437±0．0160．533±0．0221) 1．124±0．0991) SP组70．598±0．1110．838±0．0140．562±0．0220．671±0．0251)2)0．581±0．0451)2) SP+W组71．112±0．0380．842±0．0310．446±0．0150．530±0．0081)3)1．219±0．1251)3)W组 71．170±0．0820．831±0．0200．422±0．0210．509±0．0331)3)1．114±0．0451)3) 与S组比较，1)P<0．05；与I/R组比较，2)P<0．05；与SP组比较，3)P<0．05。

2.3 电镜下病理学观察 S组未观察到自噬体；多个视野下I/R组比S组自噬体增多；多个视野下SP组比I/R组减少。详见图2。

图2 电镜下病理学观察

3 讨 论

前期研究[5]以及相关文献[6]证实舒芬太尼对大鼠心肌的最佳保护剂量为1 μg/kg，且舒芬太尼的血浆浓度达峰时间为2 min左右，因此于再灌注前5 min单次股静脉给予舒芬太尼1 μg/kg后处理可以起到相应的保护作用。本实验参考相关文献[2]制备大鼠心肌缺血再灌注模型。实验结果显示：I/R组血清CK-MB明显升高，提示缺血再灌注模型制备成功。SP组与I/R组相比，血清CK-MB降低，提示舒芬太尼后处理可以在心肌缺血再灌注损伤中起到保护作用。

自噬现象在心肌细胞生理状态下即存在以维持稳态，一般认为在缺血再灌注时期，自噬表达会有一定增强。自噬过程的调节是一个较为复杂的过程，多种信号通路以及信号分子参与自噬的调控，其中较为经典且研究较多的是PI3K-Akt通路[7]，一般认为在缺血阶段自噬激活有利于细胞存活；再灌注时期，细胞缺氧、内质网应激等似的自噬过度增强，从而对细胞存活产生不利影响[8-9]。LC3是自噬常用检测分子，其在自噬泡的形成过程中起到重要作用，其具体表现为LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例上升，自噬活性相应提升。既往研究表明：舒芬太尼可通过激活PI3K-Akt通路从而产生再灌注损伤保护作用[10]。本次实验I/R组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达增加，提示自噬参与缺血再灌注损伤过程；SP组LC3-Ⅱ表达减少，提示舒芬太尼抑制自噬产生而保护作用；SP组p-Akt表达增多，提示舒芬太尼可能通过激活PI3K-Akt通路而抑制自噬；SP+W组LC3-Ⅱ表达与I/R组比较差异无统计学意义，且渥曼青霉素阻断PI3K-Akt通路后，p-Akt表达减少，自噬表达增多，提示PI3K-Akt通路可能是自噬通路中较主要的一条通路。

综上所述，舒芬太尼后处理可通过抑制自噬水平而在缺血再灌注损伤中起到保护作用，其中PI3K-Akt通路可能是主要参与机制之一。

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(本文编辑郭怀印)

Effects of Autophagy and PI3K-Akt Pathway in Sufentanil Postconditioning on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury Protection

Wang Zhihua，Tian Shouyuan，Wang Jiangang，He Xuan，Zhu Jian

Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China Corresponding Author：Tian Shouyuan (The First Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan，Shanxi，China)

Objective To investigate the roles of autophagy and PI3K-Akt signaling pathway on sufentanil postconditioning-mediated alleviation of myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI). Methods Thirty-five male Sprague-Dawley (SD) rats weighed 220 g to 260 g were randomly divided into five groups (n=7 each)：Sham operation group (group S)，ischemia-reperfusion group(group I/R)，Sufentanil postconditioning group (group SP)，sufentanil postconditioning plus Wortmannin (a specific PI3K inhibitor) group (group SP+W) and Wortmannin group (group W).In groups I/R，SP，SP+W and W，the myocardial I/R models were prepared by 30 min ligation of left anterior descending coronary artery(LAD) followed by 120 min reperfusion. Group S underwent the operation with a stitch placed around but not ligating the artery.In groups I/R，SP，SP+W and W rats were treated with 1 mL normal saline，1 μg/kg sufentanil，1 μg/kg sufentanil plus 15 μg/kg wortmannin and 15 μg/kg wortmannin intravenous infusion via the femoral vein for 5 min prior to reperfusion，respectively. Abdominal aortic blood samples were collected at 120 min of reperfusion for measurement of the serum creatine kinase-MB (CK-MB) concentration. The cardiac apexes were collected after executed the rats.The expression of Akt，phosphorylated-Akt (p-Akt) and LC3-Ⅱ were detected by Western blotting and the formation of autophagy was observed by electron microscope.Results Compared with group S，the concentration of CK-MB and the expression of LC3-Ⅱ increased in groups I/R，SP，SP+W and W，the ratio of p-Akt/Akt higher in groups I/R，SP，SP+W and W (P<0.05) and the formation of autophagy was increased. Compared with group I/R，the concentration of CK-MB and the expression of LC3-Ⅱ decreased in group SP，the ratio of p-Akt/Akt higher in group SP (P<0.05)and the formation of autophagy was decreased. Compared with group SP，the concentration of CK-MB and the expression of LC3-Ⅱ increased in groups SP+W and W，the ratio of p-Akt/Akt lower in groups SP+W and W(P<0.05)and the formation of autophagy was increased.Conclusion Sufentanil postprocessing through inhibition of autophagy in myocardial ischemia reperfusion injury play a protective role，including PI3K-Akt pathway may be one of the main mechanisms.

myocardial ischemia-reperfusion injury；autophagy；sufentanil；PI3K-Akt pathway

山西省自然科学基金面上项目(No.2014011040-4)

1.山西医科大学(太原 030001)；2.山西医科大学第一医院

田首元，E-mail：chinatsyjj@126.com

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.04.008

1672-1349(2017)04-0415-04

2016-11-02)

引用信息：王智华，田首元，王建刚，等.自噬及PI3K-Akt通路在舒芬太尼后处理心肌缺血再灌注损伤保护中的作用[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(4)：415-418.