VE对4℃保存娟珊牛精液品质的影响

陈晓英，赵 丽，马金英，旦增洛桑

（西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，拉萨 850009）

VE对4℃保存娟珊牛精液品质的影响

陈晓英，赵 丽，马金英，旦增洛桑

（西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，拉萨 850009）

为研究维生素E对4℃保存娟姗牛精液品质和抗氧化保护作用的影响，用假阴道法采集体格健硕的娟姗牛精液，在稀释液中分别添加0 mg/mL、0.01 mg/mL、0.03 mg/mL、0.05 mg/mL、0.07 mg/mL、0.09 mg/mL的维生素E，将新鲜精液稀释至1.47×106/mL，于4℃环境下保存48 h，以评价精子活力、精子顶体完整率、谷胱甘肽还原酶（GR）和过氧化氢酶（CAT）活性等精液品质指标。结果显示：娟姗牛精液4℃保存至48 h时，维生素E 0.03 mg/mL添加组娟姗牛精子活力显著高于0.05 mg/mL维生素E添加组（P＜0.05），极显著高于对照组和其他试验组（P＜0.01）；维生素E 0.03 mg/mL添加组牛精子顶体完整率极显著高于对照组和其他试验组（P＜0.01）；GR酶活性维生素E 0.03 mg/mL添加组牛达71.55 U/L，较0.05 mg/mL维生素E添加组和0.07 mg/mL维生素E添加组高，且差异显著（P＜0.05），较对照组和其他添加组差异极显著（P＜0.01）；维生素E 0.03 mg/mL添加组牛精子CAT值达5.68 U/mL，极显著高于对照组和其他添加组（P＜0.01）。说明在精液稀释液中添加0.03 mg/mL的维生素E可明显提高4℃环境保存娟姗牛精液的品质。

维生素E；娟姗牛；温度；精液品质

娟姗牛是源自英吉利海峡杰茜岛的进口奶牛，是英国政府颁布法令保护的珍贵牛种，其最大的优点是乳质浓厚，乳脂、乳蛋白含量均明显高于普通奶牛，优质乳蛋白含量达3.5%以上［1］。鉴于娟姗牛较其他高产奶牛品种体型小、乳脂率高，在高海拔地区饲养适应能力强等特点，在西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所为技术支撑单位，各级各类黄牛改良项目的支撑下，以娟姗牛精液改良西藏本地黄牛取得了显著成效。

娟姗牛精液保存技术在低海拔地区已非常成熟，但推广应用于高海拔地区后，由于配种环境温度和技术员的操作熟练程度等因素，影响了解冻后人工授精母牛的受胎率。常温保存人工授精的效果好，且方便经济，但受到保存时间的限制［2-3］，随着保存时间的延长公猪精液会引发脂质过氧化，超氧化物歧化酶（superoxidas dismutase，SOD）活力下降和丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）含量［4-5］降低，最终引发脂质过氧化，降低体膜电位，提高等离子体膜透性，最终影响受胎率。而维生素E是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是最主要的抗氧化剂之一，不易被酸、碱及热破坏，但却极易被氧化。维生素E对线粒体、网状组织或浆膜的磷脂有着特殊的亲和性，存在于这些膜的特定部位。维生素E是重要的抗氧化剂，能通过抑制自由基的形成，阻止诱发的膜脂质发生过氧化，从而维持精子顶体膜的完整，提高精子顶体完整率和降低精子畸形率［6-7］。

4℃低温保存，精子代谢活动水平低，脂质过氧化程度低，保存时间比常温更长，同时可应用普通冰箱保存，经济方便［8］。本研究拟在稀释液中分别添加0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mg/mL的维生素E，将娟姗牛新鲜精液稀释至1.47×106/mL，于4℃环境保存48 h，以精子活力、精子顶体完整率、GR酶活性和CAT酶活性为评价精液品质指标，探讨维生素E对娟姗牛精液品质的影响，以期为娟姗牛精液低温保存的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物与材料

1.1.1 试验动物与试验地点 试验牛为成年、体格健硕的5头娟姗牛。试验时间为2016年6—9月，地点为西藏日喀则市江孜县、西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所。

1.1.2 主要设备与试剂 牛用假阴道（西藏牧乐农业科技有限公司提供），倒置荧光显微镜（IX73奥林巴斯），电热恒温水槽 （DKB-450A上海森信），变频冰箱（BCD-649WDVC海尔），-80℃冰箱（MDF-U33V合肥荣事达三洋电器股份有限公司）。

维生素E（宜昌人福药业有限责任公司），考马斯亮蓝（国药集团化学试剂有限公司），Diff-Quik Stain染液（北京普博斯），牛用精液稀释液（西藏牧乐农业科技有限公司提供），谷胱甘肽还原酶（GR）和过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

新鲜娟姗牛精液来自西藏自治区日喀则市江孜县某奶牛养殖专业合作社。

1.2 试验方法与内容

1.2.1 牛用精液稀释液 参照厂家提供的说明书使用。

1.2.2 精液采集及处理 采用假阴道法于每周二和周五上午9：00采集体格健硕的娟姗牛精液。鲜精经过常规检测，活力大于0.60，密度在1.47×109/mL以上的正常精液用于本次试验。采用一步稀释法对精液进行稀释，稀释后的精液浓度在1.47×106/mL以上。用6层以上纱布包裹后放入培养箱中，17℃平衡2h后，放入冰箱4℃保存。

1.2.3 精子质量评价 精子活力和精子畸形率两项精液常规性状参照世界卫生组织标准（WHO）［9］的方法测定，具体方法如下：

精子活力：精液过滤后立即在显微镜下观察精子活力，采用百分制法，直线前进精子数占总精子数的百分比为精子活力。

精子顶体完整率参照文献［10］采用考马斯亮蓝R250染色法进行评价。

1.2.4 精液GR和CAT活性的测定 参照GR和CAT测定试剂盒说明书进行。

1.3 试验设计

试验分6组，在稀释液中分别添加0、0.01、0.03、0.05、0.07和0.09 mg/mL的维生素E，将牛新鲜精液稀释至1.47×106/mL，用6层以上纱布包裹后放入培养箱中，17℃平衡2 h后，放入4℃冰箱保存48 h，检测娟姗牛精子活力、精子顶体完整率。

每次采精后收集精液，取2 mL鲜精液于玻璃离心管中，在4 000 r/min离心分离15 min，取精浆分装于5 mL塑料离心管，置-80℃冰箱保存备用，用于精浆GR和CAT测定。试验重复3次。

1.4 数据处理

所得试验数据用Excel进行前期处理，再用SPSS11.5软件进行One-WayANOVA方差分析，并进行多重比较，试验结果用“平均数±标准差”表示，检验误差为5%和1%。

2 结果与分析

2.1 维生素E对4℃保存娟姗牛精液品质的影响

由表1可以看出，娟姗牛精液4℃保存至48 h时，维生素E 0.03 mg/mL添加组娟姗牛精子活力显著高于0.05 mg/mL维生素E添加组（P＜0.05），极显著高于对照组和其他试验组（P＜0.01）；维生素E 0.03 mg/mL添加组精子顶体完整率也极显著高于对照组和其他试验组（P＜0.01）。

2.2 维生素E对4℃保存娟姗牛精液GR和CAT的影响

由表2可以看出，娟姗牛精液4℃保存至48 h时，维生素E 0.03 mg/mL添加组娟姗牛精子GR酶活性达71.55 U/L，显著高于0.05 mg/mL维生素E添加组和0.07mg/mL维生素E添加组（P＜0.05），极显著高于对照组和其他添加组（P＜0.01）；维生素E 0.03 mg/mL添加组娟姗牛精子CAT值达5.68 U/mL，极显著高于对照组和其他添加组（P＜0.01）。

表1 维生素E对4℃保存48 h娟姗牛精液品质的影响

表2 维生素E对4℃保存48 h娟姗牛精液GR和CAT的影响

3 讨论

精子的活力与受精能力密切相关，既是评定冻后精液品质的重要指标，又是评定解冻后精子是否具备输精资格的重要因素［11］。

Sarlos等［12］研究发现，维生素E是动物机体最重要的抗氧化剂，它可以通过抑制体内自由基的形成，阻止诱发膜脂质发生过氧化，最终提高动物精子顶体完整率和降低精子畸形率。Elizabeth等［13］研究表明，维生素E还能防止精子发生冷休克，提高冻精解冻后的精子活力，从而提高受精率。赵晓娥等［14］在波尔山羊冻精的稀释液中添加维生素E，发现解冻后的波尔山羊精子活力较对照组明显升高。补饲维生素E不仅可有效减少兔子精液中活性氧（ROS）的产物，而且还可有效改善精液品质［15］。本试验证明维生素E可以提高高海拔环境下饲养的娟姗牛精液4℃保存48 h后精子的活力和顶体完整率，保护精浆中的GR酶活性和CAT酶活性，从而提高精液品质。

维生素E 0.03 mg/mL添加组娟姗牛的精子活力和顶体完整率均显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）高于其他添加组；且维生素E 0.03 mg/mL添加组对精浆中的GR酶活性和CAT酶活性起到最大保护作用，4℃保存48 h娟姗牛精液GR可达71.55 U/L，CAT值可达5.68 U/mL。

4 结论

在精液稀释液中添加维生素E 0.03 mg/mL可有效提高4℃保存48 h娟姗牛精液精子的活力和顶体完整率，保护精浆中的GR酶活性和CAT酶活性，进而提高精液品质。本研究不仅可为娟姗牛精液低温保存的进一步研究奠定基础，而且还可为高海拔地区奶牛繁育技术力量薄弱的基层技术人员提供技术参考。

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Effects of Vitamin E on the Semen Quality of Jersey Cattle at 4℃

Chen Xiaoying，ZhaoLi，Ma Jinying，et al
（Institute ofAnimal Science，Tibet AcademyofAgricultural and Animal HusbandryScience，Lhasa 850009，China）

In order toinvestigate the effects ofvitamin E on the qualityand antioxidation ofsemen at 4℃in Jerseycattle，the sperm motility，acrosome integrityrate，glutathione reductase（GR），catalase（CAT）activityofsemen，which were diluted to1.47×106/mL with dilutions with different additions of vitamin E（0 mg/mL，0.01 mg/mL，0.03 mg/mL，0.05 mg/mL，0.07 mg/mL，0.09 mg/mL）and stored at 4℃for 48 h，were studied.The results showed that the sperm motility in the group of 0.03 mg/mL was significantly higher than that in the group of 0.05 mg/mL（P＜0.05）and extremely significantly higher than those in other groups（P＜0.01）；the acrosome integrity rate in the group of 0.03 mg/mL was extremely significantly higher than those in other groups（P＜0.01）；the glutathione reductase（GR）activity in the group of 0.03 mg/mL reached 71.55 U/L，significantly higher than those in the groupsof0.05mg/mLand0.07mg/mL（P＜0.05），extremelysignificantlyhigherthanthoseinothergroups（P＜0.01）；thecatalase（CAT）activityreached 5.68 U/L，extremelysignificantlyhigher than those in other groups（P＜0.01）.It was concluded that the addition of vitamin E at the concentration of0.03 mg/mLin the dilution could improve the environment for storingJerseycattle semen at 4℃.

vitaminE；Jerseycattle；temperature；semenquality

S823.3

A

2095-3887（2017）02-0008-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.02.003

2017-01-06

西藏自治区自然科学基金（2016ZR-15-51）

陈晓英（1981-），女，助理研究员，硕士，主要从事高原奶牛生产和疫病防控研究工作。