重组蛋白纯化研究进展

蒋世强　潘能庆　鄢航

摘要 随着基因工程技术的快速发展，重组蛋白表达技术越来越成熟，然而重组蛋白的分离纯化技术相对落后限制了重组蛋白的应用。本文着重介绍了目前重组蛋白分离纯化的主要技术及其特点和应用范围。

关键词 重组蛋白；分离；纯化

中图分类号 Q513 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）04-0250-02

Abstract With the rapid development of genetic engineering technology，the expression of recombinant protein is more and more mature，but the relatively backward technique of separation and purification of recombinant protein limits its application.This review focused on introducing the technique of separation and purification of recombinant proteins and its characteristics and application scope.

Key words recombinant protein；separation；purification

近年来，基因工程技术的突飞猛进，使得医学基础学科发生了根本性的变化，也快速促进了生物医药行业的发展。目前，有不少通过基因工程技术开发的生物医药已经处于研发后期，更有些药物的研发已经进入应用阶段。尽管很多不同种类的蛋白通过基因工程技术在体外成功表达，然而在基因工程下游工作中的蛋白纯化技术还不够成熟，据有人统计，基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。因此，基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术将成为目前医药开发的瓶颈，也是未来最具有潜力的突破方向，更是生物医药商业化必须攻克的难题。

1 蛋白分离纯化的原理

目前，对于基因工程技术生产的重组蛋白的纯化方法有很多，按照大类可分为沉淀技术、层析技术、双液相萃取技术等。不管是哪一种方法，其分离纯化的原理都是利用其物理和化学性质的差异，物理性质包括分子的大小、形状、溶解度，化学性质包括等电点、疏水性以及与其他分子的亲和性等性质。根据目标蛋白的物理或化学性质的不同，可以有针对性地采取不同的分离纯化方法（表1）。

2 沉淀技术

沉淀技术是比较传统的蛋白分离纯化方法，具有成本低、操作简单、回收率高、设备要求低的优点。然而该方法对蛋白的选择性不高，适用于蛋白的初步纯化和浓缩。该技术主要可以分为盐沉淀法、有机沉淀法、等电点沉淀法。

2.1 盐沉淀法

盐沉淀法是最常用的蛋白沉淀方法，其原理是利用盐离子的水化作用使蛋白表面的水化层破坏，疏水区暴露，蛋白由于疏水作用面发生沉淀。不同的蛋白在不同盐浓度下析出，因而可以通过缓慢改变盐的浓度使不同的蛋白分级沉淀，达到分离纯化目的。在盐沉淀方法中，最常用于沉淀的盐是硫酸铵，其优点有价格便宜、溶解度大、温度影响小、对蛋白的活性影响小。

2.2 有机沉淀法

有机沉淀法是利用有机溶剂降低水活度，破坏蛋白表面水化膜，引起蛋白的沉淀。该方法的优点是有机溶剂易分离，能使蛋白快速脱盐与浓缩，但是容易升温造成蛋白变性，因此需要在低温下操作[2]。常用于沉淀蛋白的有机溶剂有丙酮、乙醇和甲醇等，其中乙醇本身无毒且易挥发，因此适用于药物蛋白的纯化。

2.3 热沉淀方法

热沉淀方法是利用不同蛋白的热稳定性不同，从而通过加热的方式除去热稳定性差的蛋白，最后剩下热稳定性高的蛋白，达到分离纯化目的。该方法的优点是操作简单、成本低；其缺点在于有较大的局限性，仅适用于纯化耐热蛋白。因此，使用该方法前，必须充分了解并确定目的蛋白的热稳定性。徐春晓等[3]利用热沉淀法纯化了可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ，杨伟伟等[4]利用热沉淀法纯化了乙醛脱氢酶。

2.4 等电点沉淀法

等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。在大多數的时候，并不能知晓杂蛋白的等电点，而且蛋白质在等电点时还存在一定的溶解度，使目的蛋白沉淀不完全。因此，等电点沉淀法不适合单独使用，更适合作为辅助方法，结合其他纯化方法来实现蛋白的沉淀分离。例如，将等电点沉淀法与盐沉淀法相结合，便可取得较好的分离效果。

3 层析技术

3.1 分子筛凝胶层析

分子筛凝胶层析利用蛋白分子大小和形状的不同进行分离。以惰性细颗粒基质作为层析柱填料，由于液体的挤压，大分子物质因无法进入细颗粒的微孔中而随着液体从细颗粒间的缝隙流出，而小分子因进入细颗粒基质内微孔运动速度慢，保留时间长，比大分子物质流出缓慢而分离。此种层析方法条件温和，填料分辨率高，操作简便，但是上样量较小，处理周期长，应用范围受限[5]。

3.2 离子交换层析

离子交换层析利用蛋白分子在特定缓冲液环境下所带电荷不同而与离子交换剂之间的相互作用不同，介质表面的可交换离子与带相同电荷的蛋白分子发生交换[5-6]。该色谱柱填料的配基为离子交换剂，与蛋白组分通过静电相互作用进行结合。在洗脱过程中缓冲液离子强度的改变将使结合力由弱到强的蛋白组分依次洗脱下来，达到分离纯化的效果。在进行色谱柱选择时要报据目的蛋白的PI值以及pH耐受能力选择合适的离子交换柱。

3.3 疏水层析

疏水层析是利用蛋白分子的疏水性不同的性质开发的纯化方法。疏水层析的填料由化学性质稳定、机械强度好的载体（如琼脂糖、硅胶等）和疏水配基（如C6、C8等）组成。蛋白质表面存在着一些疏水区域，借助于疏水区域和疏水配基间的疏水相互作用力，蛋白质被吸附在色谱填料的表面，这种相互作用力包括疏水相互作用力、范德华力和静电相互作用力。因为在高盐浓度下疏水相互作用力为主导，随着盐浓度的降低，疏水相互作用力亦变小，所以具有“高盐吸附、低盐洗脱”的特点[5]。因此，利用不同蛋白质间的疏水性差异，通过改变洗脱时的盐浓度就可以对蛋白质进行有效地分离纯化。

3.4 反相层析

反相层析与疏水层析一样，都是利用蛋白分子的疏水性差异来实现分离纯化的技术。但是二者有区别，疏水层析的固定相是弱疏水配基，而反相层析的固定相含有高度非极性基团，且配基的密度要高很多，在疏水层析中用盐浓度调节蛋白与固定相之间的相互作用，而反相层析通过有机溶剂调节，通过增加有机溶剂的浓度来实现蛋白的洗脱[2]。

3.5 亲和层析

3.5.1 生物特异亲和层析。生物特异亲和层析以生物分子作为配体，可分为免疫亲和层析、凝集素亲和层析和核酸亲和层析等，另外还有以酶、粘附蛋白、受体蛋白或底物为配体的亲和层析。

3.5.2 人工配体亲和层析。人工配体亲和层析也称为通用配体亲和层析，是指利用一类人工配体对不同的蛋白质有亲和性的特点，通过亲和层析来纯化这些蛋白质的方法。主要包括金属螯合亲和层析和染料配体亲和层析等。

3.5.3 金属螯合亲和层析。金属螯合亲和层析也称固相化金属离子亲和层析，是利用固定金属离子螯合剂（如IDA和NTA）螯合二价金属离子（如Ni2+、Zn2+、Cu2+和Co2+等），再与蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基（组氨酸、色氨酸、赖氨酸等）相互作用而进行的亲和纯化。金属螯合亲和层析具有配体简单、通用性强、分离条件温和、吸附量大等优点。Ueda等[7]应用Ni离子亲和层析，并结合分子筛层析，分离得到大肠杆菌表达的人催乳素，其纯度达到99.5%。

4 双水相萃取技术

双水相萃取技术是指把2种聚合物或1种聚合物与1种盐的水溶液混合在一起，由于聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性形成两相，而不同蛋白质在这两相中的溶解性不同，因而最终平衡时蛋白会按照一定比例分配在这两相之中，当这个分配比例相差较大时，即目的蛋白大部分都溶解在某一液相中便可达到分离的目的。Kula等[8]最早将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离，由于其条件温和、容易放大、可连续操作等特点，目前已成功应用于蛋白质分离和纯化。庞博峰[9]在18%乙醇/22%K2HPO4双水相体系中，pH=9.0条件下，使重组人胰岛素分布在上相，回收率在98%以上。

5 纯化技术组合法

目前，基因工程上游技术已经发展较为成熟，重组表达蛋白的来源也多种多样，按照表达体系可分为大肠杆菌中的原核表达体系、酵母真核表达体系；昆虫细胞真核表达体系及哺乳动物细胞真核表达体系，按照表达形式又可分为细胞外的分泌表达、细胞内可溶性表达、细胞内不溶性表达。由于不同类蛋白质的性质差异大、蛋白质本身的复杂性以及重组蛋白来源的多样性，至今也没有研发出一套适合所有重组蛋白分离纯化的技术。一般蛋白的纯化分离采取3步走的策略：第一阶段是捕获目标蛋白质，对目标蛋白进行分离、浓缩和稳定化处理，使样品体积减小，方便操作；第二阶段为中间提纯阶段，在该阶段应除去大量杂质，如宿主蛋白、内毒素等；第三阶段为最终提纯阶段，目的是获得高纯度的目标蛋白。

在实际工作中，需要根据具体情况设计纯化策略。对于所有蛋白的纯化分离过程中都需把握的原则是保证蛋白活性、回收率高、步骤尽量少、纯度高。一般来说对于蛋白的纯化都是采用不同分离纯化技术的组合使得蛋白最后的活性、纯度、回收率都较高。王晓军等[10]依次利用硫酸铵沉淀、DEAE-52离子交换柱和Sephadex G-100过滤柱3次纯化，重组蛋白的纯度达到98%，回收率为80.5%；陈爱春[11]通过Q-Sepharose阴离子交换层析、Profinity eXact亲和层析及Superdex75凝胶过滤层析的三步纯化策略，从家蚕幼虫血淋巴中纯化获得了较高纯度的无标签重组EGFP蛋白，纯化倍数为860.5，蛋白回收率为26.7%；张虎成等[12]依次利用镍柱亲和层析、SephadexG-25凝胶过滤层析和DEAE-FF离子交换层析分离纯化链球菌细胞壁蛋白。

6 展望

总的来说，目前对于基因工程表达的重组蛋白，还没有一套通用的纯化程序，只有针对某一种或一类蛋白结合不同的纯化方法得到较纯、活性较高的产品。随着科技的进步，基因工程产品的分离纯化必定会变得越来越简单，成本也会越来越低，效率更高，操作更容易。

7 参考文献

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[8] KULA M R，KRONER K H，HUSTEDT H.Purification of enzymes by liq-uidliquid extraction[M].Springer Berlin Heidelberg，2006：73-118.

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[10] 王晓军，惠俊峰，米钰，等.重组类人胶原蛋白的分离纯化[J].中国生物制品学杂志，2003，16（4）：212-214.

[11] 陈爱春.无标签重组蛋白在家蚕中的表达与纯化[D].镇江：江苏科技大学，2013.

[12] 张虎成，张征田，杨国伟，等.重组蛋白G基因工程菌高密度发酵及其分离纯化[J].基因组学与应用生物学，2013（3）：347-352.