可用于血清游离铜快速检测的特异性识别元件

熊亚敏，黄沛力

首都医科大学公共卫生学院，北京 100069

铜是生命体必需的微量元素之一，广泛分布于生物组织中，其可作为辅酶因子参与生命活动，也可以参与红细胞的形成，同时内环境中铜离子的稳定亦是维持机体健康的前提。随着铜在制造业、化工及药物合成等领域的广泛应用，人们通过环境暴露、职业暴露以及医源性暴露等接触铜的机会越来越多，生物体摄入过量的铜后产生的大量自由基，可对造成机体氧化损伤[1-2]。美国环境保护署(EPA)中规定饮用水中Cu2+的限值为1.3 mg·L-1，我国《生活饮用水卫生标准》(GB5749—2006)中规定饮用水中Cu2+的限值为1.0 mg·L-1。铜进入血液后先与白蛋白松散结合，90%～98%的铜被运送至肝脏内与2球蛋白牢固结合形成铜蓝蛋白，再释放到血液中。根据结合铜原子数的不同，铜蓝蛋白可分为饱和铜蓝蛋白和不饱和铜蓝蛋白。在机体中铜蓝蛋白合成障碍时会导致血液中游离铜含量增加，这些过多的游离铜在肝、肾、脑等器官沉积，从而造成器官功能障碍[3]。

同时研究发现，血清游离铜(包括血清中的自由铜离子以及与白蛋白、氨基酸松散结合的铜离子)过量与肝豆状核变性(Wilson disease，WD)、阿尔兹海默病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、血管性痴呆(vascular dementia，VD)等疾病有关[4-8]。以血清游离铜作为铜代谢障碍相关疾病临床诊断生物标志物及治疗过程评价指标的研究受到了广泛关注[9-10]。临床上，血清游离铜含量一般通过计算血清总铜与铜蓝蛋白结合铜的差值得到，计算公式为：游离铜=血清总铜(mg·L-1)-0.3×铜蓝蛋白(mg·L-1)/100，或游离铜=血清总铜(mol·L-1) -0.049×铜蓝蛋白(mg·L-1)[11-12]。然而该计算方式在超过20%的病人中得到阴性结果，可能的原因在于采用免疫沉淀法测得的铜蓝蛋白包括不饱和铜蓝蛋白，使铜蓝蛋白结合铜部分结果偏高[13]。另外，血清游离铜还可通过采用EDTA等螯合剂将游离铜从白蛋白等蛋白质上剥离，经超滤后通过电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)、原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等方法进行测定[14-16]，这些检测方法虽然结果准确，灵敏度高，但所需仪器昂贵，操作难度大，样品前处理复杂，且对操作人员要求高，在基层医院难以普及。因此，发展快速、灵敏、简便的高选择性血清游离铜检测方法具有重要的临床意义。目前的研究表明，基于铜离子特异性识别元件构建的荧光或电化学检测方法的出现，使得游离铜的快速灵敏检测成为可能。由于构建快速检测铜离子方法的关键在于如何选择和设计能对铜离子特异性响应的识别元件，因此本文对常用的铜离子特异性识别元件进行了归类与概述。

1 有机小分子(Organic small molecules)

有机小分子对Cu2+的识别主要是依赖于Cu2+与芳香族化合物形成螯合物后发生的荧光淬灭现象。Kim等[17]利用水溶性有机化合物4,5-二羟基-1,3-苯二磺酸在Cu2+存在时的荧光淬灭性质，实现了Cu2+的特异性检测，检测范围为0.03～0.64 mg·L-1，其对河水中Cu2+的检测结果与AAS和ICP-MS的检测结果一致。Mayr等[18]将识别及信号分子荧光黄染料固定在植入亲水性聚合物中的纤维素颗粒上，用于饮用水及废水中Cu2+的检测，检测范围为0.00063～6.3 mg·mL-1，响应时间随Cu2+浓度的不同而变化，废水中共存的Fe3+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+、Ca2+等对检测的干扰可忽略。研究表明N-aryl-3-aminopropionic acids[19]系列水溶性化合物也可用于天然水和工业废水中Cu2+的检测，检测范围为0.005～3.0 mg·mL-1，其中N,N-di(2-carboxyethyl)aniline可用于婴幼儿奶粉中1～12 mg·kg-1Cu2+的检测[20]。

由于复杂样品中可能有多种可引起荧光淬灭的成分，基于有机小分子荧光淬灭的“turn-off”检测方式在生物样品和细胞内检测Cu2+产生假阳性信号的概率较高，因此基于有机小分子荧光增强的“turn-on”检测模式受到了科研工作者的广泛青睐。Yu等[21]合成了能特异性识别Cu2+并产生“turn-on”荧光信号的有机小分子罗丹明B酰肼类衍生物(Rhodamine B hydrazide derivative)，在Cu2+存在下该化合物所产生的荧光信号增强，除Hg2+外，过量的其他金属离子对信号干扰极小，被应用于Hela细胞中Cu2+的双光子成像。此外，Cu+也可选择性地去除荧光屏蔽基团，Taki等[22]研究发现，Cu+可使MeO-fluorescein和TokyoGreem衍生物的C-O断裂并氧化产生荧光，尽管Cu2+无此效应，但Cu2+可被GSH快速还原为Cu+，从而被探针识别并产生荧光，具有细胞渗透性的TokyoGreem衍生物也被用于Hela细胞中Cu2+成像。尽管以上有机小分子荧光探针能够应用于Cu2+的选择性检测，但均存在不可逆的缺陷，不适用于检测Cu2+水平随时间的变动，Yang等[23]首次报道了一种可逆性Cu+荧光探针，硫冠醚修饰的三芳基吡唑啉荧光探针可选择性结合Cu+并通过光致电子转移产生荧光增强信号，被用于可视化监测NIH3T3细胞对铜离子吸收和排放的动力学变化。

Cu2+可在碱性溶液中催化鲁米诺(luminol)、光泽精(lucigenin)、洛粉碱(lophine)与过氧化氢(H2O2)反应产生化学发光，化学发光强度与Cu2+浓度有关[24-25]。Lind等[26]将荧光素-NH2OH-化学发光体系用于血清中Cu2+的检测，线性范围为0.001～0.02 mg·L-1，除Fe2+和Fe3+外，其他金属离子对检测干扰较小。1,10-菲罗啉、巯甲丙脯氨酸与H2O2系统也可在碱性条件下被Cu2+识别并催化产生化学发光[27-28]。尽管这些有机小分子作为Cu2+的特异性识别元件，其设计简单灵活，构建Cu2+检测传感器时无需额外加入信号分子，检测方法快速简便。但是它们通常合成条件苛刻，且Cu2+对这些有机荧光分子和化学发光底物的识别特异性稍差，其测定易受到其他过渡金属离子的干扰，所以，在检测前需要通过沉淀、吸附、加入掩蔽剂等方式去除或屏蔽干扰离子，增加了检测的复杂性，因此难以用于成分不明确复杂样品中Cu2+的检测。

2 纳米材料(Nanomaterials)

纳米材料由于量子效应使其具有不同于大尺寸材料的独特性质，如卓越的光、电、磁及催化活性等，其作为信号分子或识别分子已被成功用于DNA、蛋白质和小分子检测领域。其在Cu2+检测方面的应用亦受到了广泛关注，如纳米金、量子点等[29-31]。

纳米金(AuNPs)具有尺寸依赖的光学性质，在可见光区域有强烈的表面拉曼吸收，制备简单，稳定性好，并具有良好的生物相容性。Liu等[32]合成十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)稳定的AuNPs，在S2O32-存在下反应生成Au(S2O32-)23-络合物，使部分AuNPs被溶解，AuNPs表面的等离子体共振(SPR)吸收降低，由于Cu2+可催化这一反应过程，且SPR吸收强度与Cu2+浓度负相关，Liu等将这一基于Cu2+对AuNPs蚀刻的传感器用于自来水以及消解后的哈喇样品中Cu2+的检测，其结果与ICP-MS检测结果相一致。

量子点(QDs)因具备可协调发射光谱、高荧光量子产率和光稳定性等优越性能已被用于对Cu2+的检测[33-35]。Nurerk等[36]分别以巯基乙酸(TGA)、3-巯基丙酸(MPA)和谷胱甘肽(GSH)为稳定剂合成CdTe QDs用于水溶液中Cu2+的检测，并对比了不同稳定剂对检测灵敏度和特异性的影响，发现TGA和MPA修饰的QDs在检测时会受到Ag+的干扰，GSH修饰的QDs对Cu2+的选择性最高，检测限为0.06 μg·L-1。基于QDs表面阳离子交换的Cu2+检测方法大多易受到Hg2+和Ag+的干扰，主要是由于三者均可取代QDs表面的Cd2+导致荧光淬灭。Jin等[37]在检测体系中加入硫代硫酸盐在QDs表面形成钝化层，加入金属离子后，Cu2+仍可取代Cd2+，而Hg2+和Ag+被钝化层阻挡，显著改善Cu2+检测的灵敏度和选择性，检测限低至0.14 nmol·L-1。

Cu2+与石墨烯量子点(GQDs)表面的羧基结合，产生能量转移导致GQDs的荧光淬灭，响应区间为0.1～10mol·L-1[38]。根据荧光共振能量转移机理，GQDs表面的羧基个数对检测灵敏度有较大影响，Li等[39]采用K2S2O8对合成的GQDs进行后氧化处理，增加GQDs的氧化程度并将其用于水中Cu2+的检测，检测范围为0～20mol·L-1。Baruah等[40]利用氧化石墨烯量子点(GOQDs)作为交联剂诱导聚乙二醇(PVA)形成嵌合有GOQDs的水凝胶，Fe2+、Co2+和Cu2+可与GOQDs表面的-NHR基团形成金属离子复合物，并从水凝胶中释放到溶液中使溶液呈现相应的颜色，该过程可通过UV-vis光谱检测，Cu2+检测限为10-7mol·L-1。

相比于强度型探针容易受环境条件、仪器效率、探针浓度等因素的影响，比率型荧光探针则可通过2个或多个发射波段的自校准消除探针浓度与环境因素等改变对测量体系的扰动[41-42]。Zhu等[43]构建双发射比率型荧光探针选择性检测细胞内Cu2+，包覆在硅壳内的CdSe (em=644 nm)仅作为参考信号消除背景信号的干扰而对Cu2+无响应，N-(2-aminoethyl)-N,N,N’tris(pyridin-2ylmethyl)ethane- 1,2-diamine (AE-TPEA)功能化的碳量子点(CQDs) (em=485 nm)与CdSe杂交形成壳核型双发射QDs，Cu2+淬灭CQDs的蓝色荧光而不影响CdSe的红色荧光，因此I485/I644随着Cu2+浓度产生连续变化，检测范围为5×10-6～2×10-4mol·L-1。Yao等[44]通过EDC/NHS偶联2种不同发射波长的CdTe QDs形成双发射荧光探针，直接利用Cu2+淬灭QDs荧光的特性，实现了水中Cu2+的可视化检测，随着Cu2+的加入，探针由绿色连续变为红色，检测限为1.1 nmol·L-1。Liu等[45]将罗丹明B (em=585 nm)封装于硅纳米颗粒内，并在其表面修饰CQDs (em=467 nm)，在0～3×10-6mol·L-1范围内I467/I585与Cu2+浓度呈负相关，检测限35.2 nmol·L-1，成功应用于MCF-7细胞中Cu2+的成像。上述几种比率型荧光探针均是将参比信标封装于纳米硅颗粒内，极大地降低了QDs的荧光强度，Zou等[46]通过EDC/NHS法在硅纳米颗粒表面共价修饰特异性识别Cu2+并产生荧光淬灭的CdTe/CdS QDs (红光)，并在CdTe/CdS QDs表面共价修饰对Cu2+不敏感的蓝光碳点(CDs)作为参比信号，构建了比率型荧光纳米探针，并对Hela细胞中的Cu2+进行了成像分析。

纳米材料既可作为Cu2+特异性识别元件，亦是检测的信号分子，以其为识别元件构建的Cu2+检测方法具有灵敏度高、信号稳定等优势，可实现样品中痕量Cu2+的高灵敏检测。然而纳米材料的生物相容性较差，在生物样本中易发生团聚或降解，造成灵敏度下降，限制了其在生物样品检测中的应用。

3 生物分子(Biomolecules)

3.1 肽链

传统荧光化学传感器的识别元件多为有机物构成的螯合剂，其合成条件严格且与Cu2+的结合多为不可逆。而金属结合蛋白中的肽基序能够保持其金属离子选择性，且肽链合成简单，成本低，其作为特异性识别生物分子已在很多金属离子检测传感器的设计中得到应用[47-48]。研究发现，氨基酸残基中的Gly-Gly-His序列是Cu2+的结合位点，其选择性可通过改变肽链的骨干结构得以实现。Zheng等[49]设计的Gly-Gly-His-Gly序列可以与Cu2+1:1结合，结合常数为3.8×106；Kerim等[50]用Gly-His-Leu-Leu-Cys肽链修饰CdS QDs设计了对Cu2+和Ag+具有双重响应的荧光探针。Brianna等[51]以甘氨酸和天冬氨酸合成肽链(Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly)做为识别分子并利用荧光共振能量转移原理构建荧光探针，在pH 7.0的条件下，该探针对Cu2+表现出高灵敏度和选择性，检测限为32g·L-1。Bishnu等[52]设计了骨架为Cys-X-Gly-His-X-Gly- Glu的金属离子识别分子，并发现当X为Gly时，该肽链表现出对Cu2+的特异性识别，当X为Pro时，可特异性识别Zn2+，结合常数分别为4.9×1012和6.8×106。

金属和金属配合物可催化短肽中的肽键水解，多肽和蛋白质在金属离子作用下的选择性切割在分子生物学和生物化学中具有重要意义。Cu2+能够特异性识别多肽中的“NDKTHC”序列，并切割Lys和Thr形成的肽键，切割效率与Cu2+浓度有关。吕晓利等[53]设计“Ser-Asp-Lys-Ser-His-Thr-Lys”多肽链识别Cu2+，肽链两端分别标记荧光基团和淬灭基团，Cu2+存在下切割肽链断裂，荧光基团远离淬灭基团，荧光恢复，该设计可大大降低背景荧光，提高探针检测灵敏度，其在水中的检测限为10 nmol·L-1。

以肽链为识别元件的Cu2+检测方法具有肽链合成简单、成本低、生物相容性好等优点，但在进行生物样品检测时，肽链易受到样本中酶的作用而发生水解。肽链的防酶切保护是将其应用于生物样品中特异性识别Cu2+所面临的最大挑战。

3.2 功能化核酸

功能化的脱氧核糖核酸(DNA)包括DNA酶(DNAzyme)和核酸适配体(Aptamer)已在细胞和生物大分子检测中得到了广泛的应用。Cu2+依赖的DNAzyme (Cu-DNAzyme)和Cu2+核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的，对Cu2+具有特异性识别功能的DNA片段。

Cu-DNAzyme是由Carmi等[54-56]筛选得到的，由2条DNA链组成：具有酶活性的序列和与之互补的底物序列，在没有Cu2+时，Cu-DNAzyme不具有催化活性，2条DNA链通过碱基互补配对形成稳定的双螺旋结构，当Cu2+存在时，Cu-DNAzyme催化切割底物链，双螺旋结构降解并释放出切割后产生的底物链碎片。通过在底物链上修饰信号分子，可构建比色、荧光、化学发光或电化学传感器检测Cu2+。Liu等[57]在2007年首次使用Cu-DNAzyme构建“turn-on”荧光生物传感器，在几分钟内实现对水中Cu2+的高选择性灵敏检测，检测限35 nmol·L-1。随后，一些以Cu-DNAzyme为特异性识别分子的Cu2+检测方法得到建立。Lu等[58]以AuNPs为载体，同时修饰Cu-DNAzyme和Zn-DNAzyme，并分别在底物上标记不同发射波长的荧光染料及对应的淬灭剂，实现了活细胞内Cu2+和Zn2+的成像及原位同时检测。Yin等[59]采用一段具有HRP活性的DNA酶(HRP-DNAzyme)序列将Cu-DNAzyme与底物序列连接，其在Cu2+存在下，底物序列被切割释放后，HRP-DNAzyme序列形成G-四聚体结构，捕获Hemin而产生HRP催化活性，催化TMB底物显色，该方法在饮用水中的检测限为1 μmol·L-1。

具有独特光学性质的AuNPs常与Cu-DNAzyme相结合设计免标记可视化的Cu2+检测方法[60-62]，其原理为底物链被Cu-DNAzyme催化切断后会诱导AuNPs聚集从而引起检测体系颜色的变化。同时相关的研究表明，通过在电极上结合Cu-DNAzyme及其底物链，当Cu2+存在时，Cu-DNAzyme可切割底物链，对电化学信号产生循环放大，从而实现对Cu2+的高灵敏检测[63-64]。另外，随着UO22+，Pb2+等金属离子依赖的DNAzyme的发现，基于DNAzyme的金属离子检测微阵列被开发并应用于多种金属离子的快速同时检测[65]，其高灵敏度、高选择性和高通量的特点使其在环境检测、食品安全检测、临床诊断等方面具有很大的应用潜能。

Cu2+核酸适配体是由Qu等[66]在2016年筛选得到的，目前未见有文献报道基于Cu2+核酸适配体作为识别分子所建立的Cu2+检测方法，但作为被称为“化学抗体”的核酸适配体，其在Cu2+选择性检测方面必将具有广阔的应用前景。

3.3 抗体

功能化核酸合成简单、化学稳定性好、特异性高、生物相容性好。然而，将其应用于生物样本的检测仍然存在着易被酶解的不足。免疫检测是利用抗体与抗原的特异性结合对待测物质进行分析，抗体对相应抗原的识别具有高度特异性，且其作为完整蛋白在生物样本中的稳定性较好。免疫检测技术以其高特异性、低成本和实时快捷等优势已在生物毒素、肿瘤标志物和微生物检测等领域得到广泛应用。1985年Reardan等[67]首次分离出In3+的特异性抗体，从此开启了重金属免疫检测技术研究的先河。

Cu2+免疫检测的关键在于特异性Cu2+单克隆抗体的制备，特异性单克隆抗体制备的关键又在于重金属免疫原。Cu2+为小分子物质，在生物体内不会引起免疫反应，因此应先制备具有免疫活性的免疫原。制备Cu2+免疫原通常利用双功能螯合剂(常为EDTA或DTPA的衍生物)与Cu2+形成Cu-螯合剂复合物，螯合物为低分子量不具有免疫活性的半抗原，需将其与载体蛋白偶联，形成完整的免疫原，常用的载体蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)、卵清白蛋白(OVA)等。在成功制备重金属抗原之后，可以通过小鼠免疫、细胞融和、杂交瘤筛选、抗体纯化等步骤制备Cu2+特异性单克隆抗体。

目前，重金属离子的免疫检测都是采用抗原抑制检测的方法，可分为荧光偏振免疫检测、间接竞争ELISA免疫检测、一步法免疫检测(直接竞争ELISA法)、KinExA免疫检测和免疫胶体金快速检测方法。Liu等[68]利用p-SCN-Bn-DOPA为双功能螯合剂，KLH为载体蛋白合成Cu2+免疫原，免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤细胞筛选获得对Cu-EDTA具有高亲和力和特异性识别的单克隆抗体，并建立间接竞争ELISA法对饮用水中Cu2+和血清中游离铜含量进行检测，检测限为0.032g·mL-1，除与Hg2+的交叉反应率为7.9外，与Cd2+，Cr3+，Fe3+，Mn2+，Ca2+等其它常见金属离子的交叉反应率均小于1%，其准确度与精密度与原子吸收检测结果相比无明显差别。Kong等[69]用Cu-p-SCN-Bn-DOTA-KLH免疫BALB/c 雌性小鼠制备Cu2+单克隆抗体，并对水中Cu2+进行检测，检测限为0.003 mg·L-1，与其他金属离子交叉反应率小于1%。王玉珍等[70]利用ITCBE为双功能螯合剂，BSA为载体蛋白，免疫小鼠制备Cu2+单克隆抗体，并建立间接竞争ELISA检测Cu2+，检测限为2.15 ng·mL-1，与Cd2+、Zn2+、Hg2+、Cr3+、Pb2+等金属离子与EDTA螯合物的交叉反应率小于0.1%。

Ouyang等[71]在间接竞争化学发光(CLIA)免疫检测Cu2+的基础上，利用Cu-EDTA自身具有的催化Luminol-H2O2化学发光的性质，建立了一种免标记增强化学发光免疫检测Cu2+的方法。与传统的CLIA相比，免标记CLIA检测限更低(0.33 ng·mL-1)、线性范围更宽(1.0～1 000 ng·mL-1)；另外，免标记CLIA的特异性来自于Cu2+单克隆抗体和Cu-EDTA催化Luminol-H2O2化学发光体系的双重特异性，避免了常见金属离子的干扰。免疫层析胶体金试纸条检测法是通过固相载体硝酸纤维膜、玻璃纤维膜等层析材料的毛细扩散作用，使样品溶液沿一定方向泳动，同时使固定于其上的胶体金标记的待测物受体或待测物与待测样品中抗原或抗体发生高亲和力的特异性免疫反应，并在检测区上富集，得到肉眼可判的显色结果。唐佳佳[72]和刘文迪[73]分别利用铜单克隆抗体制备Cu2+检测胶体金试纸条，肉眼检测限分别为200 ng·mL-1和75 ng·mL-1，在4 ℃避光保存下60 d，试纸条依然有效。

抗体作为Cu2+的识别元件具有高特异性和高亲和力的优势，但其制备过程耗时长、成本高。目前以免疫检测为核心的Cu2+检测技术尚处于起步阶段，仍然存在着不少的问题，主要表现在：商品化Cu2+单克隆抗体较少，且无统一评价标准，研究者多使用自制抗体，效价参差不齐，使各项工作的横向评价比较困难。

4 展望(Prospect)

综上所述，目前Cu2+检测所用的特异性识别元件可分为有机小分子、纳米材料和生物分子。有机小分子一般在做为识别元件的同时也是信号分子，其设计灵活，可通过不同功能基团的修饰改变其选择性；纳米材料可通过表面功能化修饰实现对Cu2+的高灵敏、特异性响应；生物分子作为Cu2+识别分子则具有良好的生物相容性，其中肽链和功能化核酸具备合成简单、成本低、易修饰等优点，而Cu2+单克隆抗体则具备对Cu2+的高特异性识别性能。因此基于上述特异性识别元件构建的Cu2+检测方法已被广泛应用于环境及食品中Cu2+的检测，但由于血清中游离铜含量较低、存在形式复杂、血清中干扰成分多等原因，其应用于血清游离铜检测的方法鲜有报道。尽管如此，或许我们可以通过对上述特异性识别元件进行修饰和改进，实现生物样品中游离铜的快速检测，其中如何进一步提高铜离子识别元件对游离铜的亲和力、特异性以及在生物样品中的稳定性和抗干扰能力是构建低成本、高灵敏、高特异性的血清游离铜快速检测方法的关键所在。

[1] Squitti R, Ghidoni R, Scrascia F, et al. Free copper distinguishes mild cognitive impairment subjects from healthy elderly individuals[J]. Journal of Alzheimers Disease, 2011, 23(2): 239-248

[2] Salustri C, Barbati G, Ghidoni R, et al. Is cognitive function linked to serum free copper levels? A cohort study in a normal population [J]. Clinical Neurophysiology Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology, 2010, 121(4): 502-507

[3] Kaplan J H, Maryon E B. How mammalian cells acquire copper: An essential but potentially toxic metal [J]. Biophysical Journal, 2016, 110(1): 7-13

[4] Song X, Li B, Li Z, et al. High serum copper level is associated with an increased risk of preeclampsia in Asians: a meta-analysis [J]. Nutrition Research, 2017, 39: 14-24

[5] Sintusek P, Dhawan A. Aberrance of serum zinc and free copper level in Wilson Disease [J]. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition, 2016: 62(5): 46

[6] Dusek P, Roos P M, Litwin T, et al. The neurotoxicity of iron, copper and manganese in Parkinson's and Wilson's diseases [J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 2015, 31: 193-203

[7] Brenner S. Aluminum may mediate Alzheimer's disease through liver toxicity, with aberrant hepatic synthesis of ceruloplasmin and ATPase7B, the resultant excess free copper causing brain oxidation, beta-amyloid aggregation and Alzheimer disease [J]. Medical Hypotheses, 2013, 80(3): 326-327

[8] Arnal N, Cristalli D O, de Alaniz M J, et al. Clinical utility of copper, ceruloplasmin, and metallothionein plasma determinations in human neurodegenerative patients and their first-degree relatives [J]. Brain Research, 2010, 1319(10): 118-130

[9] Walshe J M. Serum 'free' copper in Wilson disease [J]. QJM Monthly Journal of the Association of Physicians, 2012, 105: 419-423

[10] El B S, Trocello J M, Poupon J, et al. Relative exchangeable copper: A new highly sensitive and highly specific biomarker for Wilson's Disease diagnosis [J]. Clinica Chimica Acta, 2011, 412(23): 2254-2260

[11] Roberts E A, Schilsky M L. Diagnosis and treatment of Wilson Disease: An update [J]. Hepatology, 2008, 47(6): 2089-2111

[12] Twomey P J, Viljoen A, Reynolds T M, et al. Non-ceruloplasmin-bound copper in routine clinical practice in different laboratories [J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 2008, 22(1): 50-53

[13] Twomey P J, Viljoen A, House I M, et al. Relationship between serum copper, ceruloplasmin, and non-ceruloplasmin-bound copper in routine clinical practice [J]. Clinical Chemistry, 2005, 51(8): 1558-1559

[14] Mcmillin G A, Travis J J, Hunt J W. Direct measurement of free copper in serum or plasma ultrafiltrate [J]. American Journal of Clinical Pathology, 2009, 131(2): 160-165

[15] Favier A, Ruffieux D. Simple assay of serum copper fractions by ultrafiltration and flameless atomic absorption [J]. Biological Trace Element Research, 1988, 18(1): 145-160

[16] Elbalkhi S, Poupon J, Trocello J M, et al. Determination of ultrafiltrable and exchangeable copper in plasma: Stability and reference values in healthy subjects [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2009, 394(5): 1477-1484

[17] Kim H S, Choi H S. Spectrofluorimetric determination of copper(II) by its static quenching effect on the fluorescence of 4,5-dihydroxy-1,3- benzenedisulfonic acid [J]. Talanta, 2001, 55(1): 163-169

[18] Mayr T, Werner T. Highly selective optical sensing of copper(II) ions based on fluorescence quenching of immobilised Lucifer Yellow [J]. Analyst, 2002, 127(2): 248-252

[19] Pechishcheva N V, Osintseva E V, Neudachina L K, et al. Luminescence properties of some N-aryl-3-aminopropionic acids and their use for determination of copper(II) in drinking and waste water[J]. Doklady Chemistry, 2006, 408(1): 65-69

[20] Pechishcheva N V, Shunyaev K Y. Application of luminescence to the determination of trace copper [J]. Journal of Analytical Chemistry, 2008, 63(5): 412-423

[21] Yu M. Highly sensitive and fast responsive fluorescence turn-on chemodosimeter for Cu2+and its application in live cell imaging [J]. Chemistry, 2008, 14(23): 6892-6900

[22] Taki M, Iyoshi S, Ojida A, et al. Development of highly sensitive fluorescent probes for detection of intracellular copper(I) in living systems [J]. Journal of the American Chemical Society, 2010, 132(17): 5938-5939

[23] Yang L, Mcrae R, Henary M M, et al. Imaging of the intracellular topography of copper with a fluorescent sensor and by synchrotron X-ray fluorescence microscopy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(32): 11179-11184

[24] Abolhasani J, Amjadi M, Hassanzadeh J, et al. Determination of copper in water by ionic liquid based microextraction and chemiluminescence detection [J]. Analytical Letters, 2014, 47(9): 1528-1540

[25] Linnik R P, Zaporozhets O A. Chemiluminescence determination of dissolved copper(II) in natural waters [J]. Journal of Analytical Chemistry, 2014, 69(6): 519-524

[26] Lin J, Hobo T. Chemiluminescence investigation of NH(2)OH-fluorescein- Cu2+system and its application to copper analysis in serum [J]. Talanta, 1995, 42(11): 1619-1623

[27] Sorouraddin M H, Iranifam M, Imani-Nabiyyi A. A novel captopril chemiluminescence system for determination of copper(II) in human hair and cereal flours [J]. Journal of Fluorescence, 2009, 19(4): 575-581

[28] Chen X, Shen J, Li T. PMMA microreactor for chemiluminescence detection of Cu (II) based on 1,10-phenanthroline-hydrogen peroxide reaction [J]. Journal of Food Science and Technology, 2016, 53(1): 915-919

[29] Qing Z, Mao Z, Qing T, et al. Visual and portable strategy for copper(II) detection based on a striplike poly(thymine)-caged and microwell-printed hydrogel [J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(22): 11263-11268

[30] Tang S, Wang M, Li Z, et al. A novel sensitive colorimetric sensor for Cu2+based on in situ formation of fluorescent quantum dots with photocatalytic activity [J]. Biosensors & Bioelectronics, 2016: 89(2): 866-870

[31] Cao Z, Gu Z, Zeng J L, et al. A novel fluorescent probe for copper ions based on polymer-modified CdSe/CdS core/shell quantum dots [J]. Analytical Sciences the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry, 2011, 27(6): 643-647

[32] Liu R, Chen Z, Wang S, et al. Colorimetric sensing of copper(II) based on catalytic etching of gold nanoparticles[J]. Talanta, 2013, 112(32): 37-42

[33] Sun H, Gao N, Wu L, et al. Highly photoluminescent amino-functionalized graphene quantum dots used for sensing copper ions[J]. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany), 2013, 19(40): 13362-13368

[34] Wang Y, Lu J P, Tong Z, et al. A fluorescence quenching method for determination of copper ions with CdTe quantum dots[J]. Journal of the Chilean Chemical Society, 2009, 54(3): 274-277

[35] Zhang K, Guo J, Nie J, et al. Ultrasensitive and selective detection of Cu2+in aqueous solution with fluorescence enhanced CdSe quantum dots[J]. Sensors & Actuators B Chemical, 2014, 190: 279-287

[36] Nurerk P, Kanatharana P, Bunkoed O. A selective determination of copper ions in water samples based on the fluorescence quenching of thiol-capped CdTe quantum dots [J]. Luminescence, 2016, 31(2): 515-522

[37] Jin L H, Han C S. Ultrasensitive and selective fluorimetric detection of copper ions using thiosulfate-involved quantum dots[J]. Analytical Chemistry, 2014, 86(15): 7209-7213

[38] Lin L, Song X, Chen Y, et al. Europium-decorated graphene quantum dots as a fluorescent probe for label-free, rapid and sensitive detection of Cu2+and l-cysteine [J]. Analytica Chimica Acta, 2015, 891: 261-268

[39] Li Y, Liu X, Li Q, et al. Post-oxidation treated graphene quantum dots as a fluorescent probe for sensitive detection of copper ions[J]. Chemical Physics Letters, 2016, 664: 127-132

[40] Baruah U, Chowdhury D. Functionalized graphene oxide quantum dot-PVA hydrogel: A colorimetric sensor for Fe2+, Co2+and Cu2+ions[J]. Nanotechnology, 2016, 27(14): 145501

[41] Domaille D W, Zeng L, Chang C J. Visualizing ascorbate-triggered release of labile copper within living cells using a ratiometric fluorescent sensor [J]. Journal of the American Chemical Society, 2010, 132(4): 1194-1195

[42] He L L, Yang X H, Zhao F, et al. Self-assembled supramolecular nanoprobes for ratiometric fluorescence measurement of intracellular pH values [J]. 2015, 87(4): 2459-2465

[43] Zhu A, Qu Q, Shao X, et al. Carbon-dot-based dual-emission nanohybrid produces a ratiometric fluorescent sensor forinvivoimaging of cellular copper ions[J]. Angewandte Chemie, 2012, 124(29): 7297-7301

[44] Yao J, Zhang K, Zhu H, et al. Efficient ratiometric fluorescence probe based on dual-emission quantum dots hybrid for on-site determination of copper ions [J]. Analytical Chemistry, 2013, 85(13): 6461-6468

[45] Liu X, Zhang N, Bing T, et al. Carbon dots based dual-emission silica nanoparticles as a ratiometric nanosensor for Cu2+[J]. Analytical Chemistry, 2016, 86(5): 2289-2296

[46] Zou C, Foda M F, Tan X, et al. Carbon-dot and quantum-dot-coated dual-emission core-satellite silica nanoparticles for ratiometric intracellular Cu2+imaging [J]. Analytical Chemistry, 2016, 88(14): 7395-7403

[47] Walkup G K, Imperiali B. Design and evaluation, of a peptidyl fluorescent chemesensor for divalent zinc[J]. Journal of the American Chemical Society, 1996, 118(12): 3053-3054

[48] Zheng Y, Huo Q, Kele P, et al. ChemInform Abstract: A new fluorescent chemosensor for copper ions based on tripeptide Glycyl—Histidyl—Lysine (GHK)[J]. Organic Letters, 2002, 33(8): 3277-3280

[49] Zheng Y, Gattás-Asfura K M, Konka V, et al. A dansylated peptide for the selective detection of copper ions[J]. Chemical Communications, 2002, 21(20): 2350-2351

[50] Gattás-Asfura K M, Leblanc R M. Peptide-coated CdS quantum dots for the optical detection of copper(II) and silver(I)[J]. Chemical Communications, 2003, 21(21): 2684-2685

[51] White B R, Holcombe J A. Fluorescent peptide sensor for the selective detection of Cu2+[J]. Talanta, 2007, 71(5): 2015-2020

[52] Joshi B P, Lee K H. Synthesis of highly selective fluorescent peptide probes for metal ions: Tuning selective metal monitoring with secondary structure [J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 16(18): 8501-8509

[53] 吕晓利. 新型荧光金属离子探针的设计, 合成及性能研究[D]. 北京: 北京化工大学, 2012: 32-50

Lv X L. The research on design, synthesis and performance of new fluorescent probes for metal ions [D]. Beijing: Beijing University of Chemical Technology, 2012: 32-50 (in Chinese)

[54] Carmi N, Shultz L A, Breaker R R.Invitroselection of self-cleaving DNAs[J]. Chemistry & Biology, 1996, 3(12): 1039-1046

[55] Carmi N, Balkhi S R, Breaker R R. Cleaving DNA with DNA [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1998, 95(5): 2233-2237

[56] Carmi N, Breaker R R. Characterization of a DNA-cleaving deoxyribozyme [J]. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2001, 9(10): 2589-2600

[57] Liu J, Lu Y. A DNAzyme catalytic beacon sensor for paramagnetic Cu2+ions in aqueous solution with high sensitivity and selectivity [J]. Journal of the American Chemical Society, 2007, 129(32): 9838-9839

[58] Li L, Feng J, Fan Y, et al. Simultaneous imaging of Zn2+and Cu2+in living cells based on DNAzyme modified gold nanoparticle [J]. Analytical Chemistry, 2015, 87(9): 4829-4835

[59] Yin B C, Ye B C, Tan W H, et al. An allosteric dual-DNAzyme unimolecular probe for colorimetric detection of copper(II) [J]. Journal of the American Chemical Society, 2009, 131(41): 14624-14625

[60] Lin H, Zou Y, Huang Y, et al. DNAzyme crosslinked hydrogel: A new platform for visual detection of metal ions[J]. Chemical Communications, 2011, 47(33): 9312-9314

[61] Wang Y, Yang F, Yang X. Label-free colorimetric biosensing of copper(II) ions with unimolecular self-cleaving deoxyribozymes and unmodified gold nanoparticle probes[J]. Nanotechnology, 2010, 21(20): 3293-3294

[62] Miao X, Ling L, Cheng D, et al. A highly sensitive sensor for Cu2+with unmodified gold nanoparticles and DNAzyme by using the dynamic light scattering technique [J]. Analyst, 2012, 137(13): 3064-3069

[63] Hu W, Min X, Li X, et al. DNAzyme catalytic beacons-based a label-free biosensor for copper using electrochemical impedance spectroscopy[J]. RSC Advances, 2015, 6(8): 6679-6685

[65] Peng Z, Yin B C, Ye B C. DNAzyme-based microarray for highly sensitive determination of metal ions [J]. Biosensors and Bioelectronics, 2009, 25(4): 935-939

[66] Qu H, Csordas A T, Wang J, et al. Rapid and label-free strategy to isolate aptamers for metal ions [J]. ACS Nano, 2016, 10(8): 7558-7569

[67] Reardan D T, Meares C F, Goodwin D A, et al. Antibodies against metal chelates[J]. Nature, 1985, 316(6025): 265

[68] Liu F, Lou Y, Shi X, et al. Preparation and characterization of monoclonal antibody specific for copper-chelate complex[J]. Journal of Immunological Methods, 2013, 387(2): 228-236

[69] Kong T, Li X B, Liu G W, et al. Preparation of specific monoclonal antibodies against chelated copper ions [J]. Biological Trace Element Research, 2012, 145(3): 388-395

[70] 王玉珍, 冯锋, 白云峰, 等. 重金属铜离子酶联免疫分析方法的建立[J]. 山西大同大学学报: 自然科学版, 2016, 32(6): 36-39

Wang Y Z, Feng F, Bai Y F, et al. The establishment of enzyme-linked immunosorbent assay for heavy metal copper ions [J]. Journal of Shanxi Datong University: Natural Science Edition, 2016, 32(6): 36-39 (in Chinese)

[71] Ouyang H, Qi S, Wang W, et al. An ultra-facile and label-free immunoassay strategy for detection of copper (II) utilizing chemiluminescence self-enhancement of Cu (II)-ethylenediaminetetraacetate chelate[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2016, 85: 157-163

[72] 唐佳佳. 重金属Cu2+免疫层析胶体金试纸条的研制[D]. 吉林: 吉林大学, 2012: 38-56

Tang J J. Development of an immunochromatographic assay for the detection of copper ions [D]. Jilin: Jilin University, 2012: 38-56 (in Chinese)

[73] 刘文迪. 重金属铜单克隆抗体的制备及免疫检测方法的建立[D]. 吉林: 吉林大学, 2012: 41-55

Liu W D. Preparation of monoclonal antibodies and development of immunoassay for copper [D]. Jilin: Jilin University, 2012: 41-55 (in Chinese)