利用涂片法观察蕨类植物孢子发生发育*

戴锡玲　曹建国　王全喜

（上海师范大学生命与环境科学学院　上海　200234）

涂片法是一种将游离的细胞和动、植物中比较疏松的组织均匀地涂在载玻片上的制作方法，是常见的临时玻片标本制作方法之一［1］，适用于微小的（微生物、细胞）或呈液体状态（血液）的实验材料［2］，在观察动、植物染色体时通常采用该方法［3-5］；在研究高等植物的孢粉发育时也经常用到此方法，还有切片法［6-7］。本文将涂片法应用于蕨类植物瓶尔小草（Ophioglossum vulgatum）孢子发生发育的观察，取得了良好的效果。

瓶尔小草是多年生的小型草本蕨类植物，叶通常单生，有营养叶和孢子叶之分，孢子囊穗长2.5～3.5 cm，远超出于营养叶之上［8］（图 1，本文附图见封四）。制作涂片时，先将载玻片和盖玻片清洗干净，于载玻片的中间滴一滴蒸馏水，取不同发育时期的瓶尔小草孢子囊穗（图2），因其孢子囊由孢子囊穗基部到顶端渐次成熟［7］，因此，将孢子囊穗的上、中、下部分别折断，在断面显露2个超半圆形的孢子囊（图3），将孢子囊的断面在水滴中点蘸，使孢子囊中的大量不同发育时期的细胞（如孢子母细胞或孢子）落入水中，这些细胞群肉眼可见，然后左手持平载玻片（或放在平台上），右手用镊子夹住盖玻片，先使盖玻片的一边接触到水，且盖玻片和载玻片成45°角，在向左推的同时向下均速降盖玻片，避免产生气泡，使细胞成一薄层分布，去掉多余的水分后利用光学显微镜镜检。

在瓶尔小草孢子囊的发育早期，孢子囊内数量众多的孢原细胞为不规则多边形，排列紧密［7］，因此很难被蘸取到水滴中。当孢原细胞分裂形成孢子母细胞时，因绒毡层原生质团侵入孢子母细胞间，使之相互之间分离，且部分细胞壁变圆（图4），最终孢子母细胞呈球形，彻底彼此分离，周围绒毡层原生质团中含大量淀粉粒（图5）。随后，孢子母细胞减数分裂形成四分孢子，表面膜将四分孢子紧密包围在一起，外周的淀粉粒仍然较多（图6）。瓶尔小草四分孢子呈四面体型排列，孢子为椭球形，表面光滑，此时裂缝尚未形成（图7）。随后，在孢子近极面的质膜收缩，出现三裂缝最初的褶皱，并在孢子表面形成外壁，最初外壁很薄，较平滑；此时，绒毡层原生质团更加浓厚，其中淀粉粒的数量较孢子母细胞阶段进一步增加（图8）。随着外壁的增厚，孢子的透明度下降，裂缝加粗，长度几达孢子赤道线，孢子近极面出现少量大的疣块状突起（图9）。随着成壁物质在孢子表面的沉积，裂缝明显变短变矮，孢子表面具密集均匀的孔穴（图10）。孢子外壁厚度继续增加，表面发育出不规则低矮的脊状突起，部分脊状突起相互融合，此时，绒毡层残余物中的淀粉粒基本消失（图11）。最后，孢子发育为球形，脊状突起相互融合成网状；在孢子外壁表面形成周壁，周壁与外壁性质不同，呈褐色；此时，裂缝最短最细，长约为孢子半径的1/3（图12）。

与切片法［6-7］相比，利用涂片法观察蕨类植物孢子发生发育具有如下特点：①操作简便：涂片法观察孢子发育只需取材、折断（或切断）孢子囊、涂片、盖片、镜检等5步，只需用光学显微镜观察即可，相比切片法操作更简便，更适合于教学中采用。②不使用化学试剂：涂片法只需要蒸馏水，不需要任何化学试剂（如切片法中需要固定剂、染色剂等）。因此，涂片法相对来说更经济且环保。③观察效果直观：因涂片法在操作过程中不使用任何化学药品处理孢子，最大限度保持了孢子的活体状态，因此，孢子的形态不会发生变化（若利用切片法观察早期的孢子会出现皱缩变形等现象），使孢子各发育阶段的形状和大小特征更真实可靠。此外，该方法对孢子的颜色及裂缝和纹饰表面形态变化的观察也是切片法所无法直观观察到的。④适用于孢子囊较大的种类：蕨类植物的孢子囊大小差异较大。像瓶尔小草这样孢子囊较大的种类，不用解剖镜，徒手就可以折断孢子囊，使孢子暴露并进行涂片。而孢子囊较小的种类，例如蜈蚣草Pteris vittata，需将孢子囊在解剖镜下刺破，使孢子散发在载玻片上［9］，利用涂片法操作有难度。

蕨类植物属于高等的孢子植物，其孢子经孢子母细胞减数分裂产生，也是配子体世代的第1个细胞，在蕨类植物的世代交替中起着重要的作用。因此，利用简便的涂片法可以加深学生对蕨类植物的生活史及孢子发生发育知识的理解，培养学生的动手能力和学习兴趣，使理论知识变得直观生动。

［1］冯玉桦.玻片标本的种类和制作.生物学教学，2004，29(5)：46.

［2］朱晓林，王静，许香春.显微观察类实验中临时玻片标本的制作.实验教学与仪器，2015(2)：37.

［3］于天飞，吕建伟，李默.鸟类骨髓细胞染色体的制备.生物学教学，2010，35(6)：36.

［4］宋娟娟，唐源江，廖景平,等.濒危植物矮沙冬青减数分裂期染色体行为的观察.热带亚热带植物学报，2003，11(2)：166.

［5］黄远.新黑麦减数分裂时期的定位观察.生物学通报，2008，43(11)：53.

［6］戴锡玲，王赛赛，王全喜.团扇蕨是观察蕨类植物孢子囊发育的好材料.生物学通报，2012，47(9)：52.

［7］戴锡玲，包家茜，曹建国,等.瓶尔小草是观察厚囊蕨类孢子囊发育的好材料.生物学通报，2015，50(2)：42.

［8］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：2卷.北京：科学出版社，1959.

［9］戴锡玲，张蕾，王全喜.富砷植物蜈蚣草孢子和配子体发育的显微观察.生物学通报，2012，47(5)：55.