十字花科植物中黑芥子酶的研究进展

孙艳伟，张泽生，2，3，王田心，2，*，李雨蒙，秦程广

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457；3.天津食品安全低碳制造协同创新中心，天津300457）

十字花科植物中黑芥子酶的研究进展

孙艳伟1，张泽生1，2，3，王田心1，2，*，李雨蒙1，秦程广1

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457；3.天津食品安全低碳制造协同创新中心，天津300457）

黑芥子酶是一种存在于十字花科植物中用以水解硫代葡萄糖苷的酶，且水解产物因具有抗癌作用而受到广泛关注。对黑芥子酶的分布、结构及活性等方面进行了概述，着重介绍了十字花科植物中黑芥子酶的提取及活性测定方法，并简述了黑芥子酶的应用。

十字花科植物；黑芥子酶；硫代葡萄糖苷；研究进展

随着人们生活水平的提高，居民膳食结构中高糖、高脂食品摄入逐渐增多，过多的能量摄入可能导致癌症、动脉硬化等慢性病的发生，因此近年来防癌抗癌及慢性病防治一直是医学界及营养界的研究热点。十字花科蔬菜是我国常见的八大蔬菜之一，品种繁多，因其普遍含有天然抗癌物质而受到广泛关注。十字花科植物中含有的硫代葡萄糖苷可被黑芥子酶高效降解得到异硫氰酸酯等代谢产物[1]，研究表明异硫氰酸酯类物质不仅是形成十字花科蔬菜特有风味的化合物，还具有参与植物防御及人类癌症预防等生物活性[2-5]。近年来，黑芥子酶作为降解硫代葡萄糖苷的重要酶源，成为抗癌研究的新方向。本文主要综述了国内外十字花科植物中黑芥子酶的研究进展，旨在为黑芥子酶的进一步研究和应用提供参考。

1 黑芥子酶概述

1.1 黑芥子酶及其分布

黑芥子酶（myrosinase，EC3.2.1），又称 β-硫代葡萄糖苷酶，是一种普遍存在于十字花科植物中可将硫代葡萄糖苷高效降解的酶类[6-7]。它性质稳定，在十字花科植物的根、茎、叶、幼苗及种子中普遍存在，分布在特定的黑芥子酶细胞中[4]。另外，在一些以十字花科蔬菜为食的昆虫、哺乳动物组织、真菌及其多型拟杆菌等肠道细菌中都有黑芥子酶的存在[8-11]，研究表明胃肠道细菌来源的黑芥子酶水解硫代葡萄糖苷产生异硫氰酸酯的转化量较低（1%～40%）[12-13]。国内外对黑芥子酶的基因方面也进行了大量研究，其中拟南芥的黑芥子酶基因研究最多，并进行了相关黑芥子酶基因的克隆方面的研究[14-15]。

1.2 黑芥子酶的结构及同工酶

黑芥子酶的本质是一种糖蛋白，十字花科植物中存在多种黑芥子酶，不同来源的黑芥子酶其表观分子质量、亚基数目和侧链中糖链含量的高低不同[16-17]，导致不同来源的黑芥子酶对相同硫苷的降解率[18]和硫苷的降解产物组分[19]存在差异。黑芥子酶通常以同工酶的形式存在，据报道，大多数黑芥子酶同工酶是二聚物，其子单位的分子量介于65 kDa～75 kDa之间[20-23]，但相关研究表明山葵来源的黑芥子酶是由12个子单位构成，每个子单位的分子量大约是45 kDa[24]。迄今为止，黑芥子酶被认为是由MA、MB和MC 3种基因所编码，其中MA基因编码的黑芥子酶是以游离的二聚体形式存在，MB和MC基因编码的黑芥子酶与其他的蛋白质混合在一起，以复合体的形式存在。黑芥子酶复合体主要包括黑芥子酶、黑芥子酶结合蛋白（Myrosinase-binding protein，MBP）、黑芥子酶协助蛋白（Myrosinase-associated protein，MyAP）[25]。

1.3 黑芥子酶的活性及影响因素

不同来源的黑芥子酶活性存在很大差异，丁艳等[26]在体外研究不同来源黑芥子酶的添加对油菜籽饼粕中硫代葡萄糖苷降解产物的影响，研究表明，来源于西兰花的黑芥子酶可导致硫苷的降解产物增加，尤其是抗营养物质种类的增加；而来源于芥蓝的黑芥子酶会大大提升异硫氰酸类化合物的产量。也有研究表明即使同一来源的黑芥子酶对不同结构的硫代葡萄糖苷同样存在着反应底物的选择性和活性差异[27]。黑芥子酶在植物的不同组织和发育阶段有不同的生物活性，研究表明种子及幼苗时期黑芥子酶的活性最高[28]。另外，不同发育阶段黑芥子酶的活性也有所差别，王志英等[29]研究两种甘蓝种子的发芽过程，发现黑芥子酶的活性分别在发芽第一天和第三天达到最高，且随着种子发芽黑芥子酶的含量先上升后下降。

pH值、温度、维生素C、压力及光照等因素都会影响黑芥子酶的活性。研究表明，在pH值5～8的范围内，黑芥子酶可将硫代葡萄糖苷水解为异硫氰酸酯，而pH值酸性环境中，黑芥子酶会诱导硫代葡萄糖苷水解成硫氰酸酯、腈类等抗营养物质[30]；黑芥子酶在高温条件易变性失活，不同来源的黑芥子酶最适温度不同，研究表明，甘蓝源的黑芥子酶最适温度为60℃，而辣根源的黑芥子酶最适温度是35℃[31]；维生素C能够激活黑芥子酶，不同来源的黑芥子酶最适的维生素C浓度不同[32]，丁艳等研究油菜籽饼粕中硫代葡萄糖苷的酶解条件时发现，低浓度的维生素C有激活黑芥子酶的功能，浓度增加后，异硫氰酸酯的生成量反而降低[33]；最新的研究表明，施加适度的压力（200 MPa～400 MPa）可以有效保持黑芥子酶的活性，以便将其用于后续的硫代葡萄糖苷水解过程[34]；光照对黑芥子酶活性起着正调控作用[35]；另外，酶的底物也是影响黑芥子酶活性的重要因素[36]。

1.4 硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系统

在植物细胞内，硫代葡萄糖苷和黑芥子酶是彼此分离的，硫代葡萄糖苷存在于液泡中，而黑芥子酶以黑芥子酶蛋白颗粒的形式存在于黑芥子酶细胞中。当植物组织受到损伤或者病虫侵害时，黑芥子酶被释放出来，与硫代葡萄糖苷直接接触，并使其降解为异硫氰酸酯、硫氰酸根离子、腈类、恶唑烷硫酮等有生物活性的物质[37]。其中一些降解产物表现出毒素作用，可以抗病或抵御虫的侵害，因此，硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系统被认为是十字花科植物重要的防御系统，能调节十字花科植物与环境之间的相互作用，研究表明昆虫、病原体、酸雨、干旱、盐及重金属胁迫会引起硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系统的变化，从而影响植物防御[38]；硫代葡萄糖苷的降解产物还可以影响十字花科蔬菜的品质，赋予其特有的气味；另外，异硫氰酸酯具有杀菌、防癌等生物活性，目前的研究主要集中于其肺癌、血癌、食道癌及乳腺癌等方面的功效[39-42]。

2 黑芥子酶的提取及分离纯化

现在应用较普遍的是从十字花科种子中提取黑芥子酶，Ghawi等[43]在芥菜籽中提取出了黑芥子酶，提取方法为：首先将十字花科蔬菜的种子粉碎，取种子粉末加入缓冲溶液（pH为7.5，0.2 mol/L Tris-HCl，包含0.5 mmol/L EDTA、1.5 mmol/L二硫苏糖醇、0.4 g交联聚维酮），冰浴提取15 min后，低温离心取上清，采用硫酸铵沉淀，冰浴30 min，使其饱和度达到90%，低温离心，沉淀复溶于Tris-HCl缓冲液中，混合物采用纤维素膜和Tris-HCl缓冲液在4℃条件下透析24 h，以去除多余的硫酸铵等盐类，离心去除不溶性杂质，制备粗酶液，样品冷冻干燥备用。

另外，也可以从十字花科植物的食用部分提取黑芥子酶。Jwannyd等[44]在辣根中分离出2种黑芥子酶；Okunade[34]在萝卜根中提取出了黑芥子酶，并研究了在冷藏过程中的萝卜中黑芥子酶的活性；从食用部分提取黑芥子酶大致的步骤与上述方法相同，只是前面的处理有些差异。提取方法[14]如下：取食用部分的组织用榨汁机榨汁，加入pH 7.2的提取缓冲液（10 mmol/L磷酸钾，3 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA 和 5%甘油），在冰上以最大速度搅拌，用纱布过滤，再用低温离心40 min，弃去沉淀，在上清液中加入适量硫酸铵以达到55%～85%饱和度，之后过Sephadex G-50凝胶色谱柱，用33 mmol/L磷酸钾缓冲液洗脱，最后将得到的黑芥子酶提取物浓缩后于-80℃放置，备用。

3 黑芥子酶的活性测定

黑芥子酶的活性主要通过测定葡萄糖的生成量或底物浓度变化来决定的，测定葡萄糖生成量可以用葡萄糖试剂盒、分光光度计和气相色谱等方法。测量底物浓度的方法有：分光光度计和高效液相色谱等方法[45]。

3.1 测定葡萄糖的生成量

通过测定葡萄糖生成量来决定黑芥子酶的活性，最简单常用的方法是采用葡萄糖试剂盒，反应完成后，在340 nm处测吸光度。黑芥子酶活力单位定义为：在pH7.5，25℃且底物为黑芥子硫苷酸钾（sinigrin）的条件下，每分钟催化底物得到1 μmol葡萄糖所需要黑芥子酶的量[34]。Ghawi等[46]用试剂盒测定绿色卷心菜中黑芥子酶活性时，采用的D-葡萄糖试剂盒，试剂盒反应液为 1.51 mL，组成为：0.5 mL NADP 和 ATP、10 μL己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶、0.9 mL 7 mmol/L抗坏血酸水溶液及50 μL黑芥子酶样品。之后让反应液平衡5 min，加入50 μL 0.6 mol/L黑芥子硫苷酸钾溶液，此过程会生成NADP，导致吸光度的变化，最后在340 nm处测吸光度。Sooyeon等[47]测定萝卜中黑芥子酶的活性也是采用葡萄糖试剂盒法。另外，通过分光光度计法及气相色谱法测定葡萄糖的生成量是国内外普遍的测量方法。需要注意的是，通过测定葡萄糖生成量来决定黑芥子酶活性的方法简便快速、容易操作，但需防止样品中其他葡萄糖和糖苷键的干扰[48-49]。

3.2 测定底物浓度变化

测量底物浓度变化来决定黑芥子酶活性时，酶活力单位的定义为：在pH6.5，37℃条件下，每分钟催化1 μmol的底物所需要酶的量[50]。测量底物浓度的方法有分光光度计法和高效液相色谱法等[45]。Li等[51]在研究从辣根中提取的黑芥子酶活性时，采用的是分光光度计法：反应液由33.3 mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液及0.2 mmol/L黑芥子硫苷酸钾溶液组成，将反应液加入到石英比色皿里，之后把比色皿放到37℃的分光光度计平衡1 min后，加入100 μL黑芥子酶提取液，每隔3 min在227 nm处测吸光度，之后以时间为横坐标，吸光度为纵坐标作图，计算酶的活性。另外，也有人采用高效液相色谱法来测定底物浓度。但由于植物可能存在多种形式的硫代葡萄糖苷，所以采用测定底物浓度来决定黑芥子酶活性的方法在测量时容易遗漏部分硫代葡萄糖苷，从而影响结果的准确性[48-49]。

4 黑芥子酶的应用

4.1 在人体抗癌方面的应用

虽然十字花科植物中含有的硫代葡萄糖苷及其代谢产物异硫氰酸酯，可以发挥体内抗氧化作用，有效降低多种癌症的发病几率[52]，但是我们日常食用的十字花科蔬菜都是加热烹调的，会使得可以将硫代葡萄糖苷高效降解的黑芥子酶变性失活，且硫代葡萄糖苷也有一定的损失，所以日常通过食物摄入的硫代葡萄糖苷利用率极低[53-55]。为了保证每日这种抗癌物质的摄入，可以利用黑芥子酶在体外对硫代葡萄糖苷进行高效降解，得到异硫氰酸酯等抗癌成分，制备成纯制剂，每日进行适当补充[56-57]。因此，对黑芥子酶的深入研究及利用，对于更好地进行人体抗癌防癌有很重要的意义。

4.2 油菜籽饼粕脱毒

油菜籽饼粕富含蛋白质和氨基酸，但硫代葡萄糖苷的存在限制了其在食品及饲料方面的应用，大量的油菜籽饼粕被用作肥料，造成了资源的浪费。硫代葡萄糖苷虽然本身无毒，但油菜籽饼粕及牲畜肠道微生物中都含有黑芥子酶，能够将硫代葡萄糖苷降解生成抗营养物质，容易造成毒副作用[58]。因此，要想促进油菜籽饼粕的利用，必须对其进行脱毒，但如果采取强酸、高温等条件，又会造成油菜籽饼粕中其他营养成分的损失。采用外源黑芥子酶，对油菜籽饼粕进行脱毒处理，条件温和，既能降低硫代葡萄糖苷的含量，又能保护其他营养成分不被破坏[25]。丁艳等[26]比较分析了7种黑芥子酶降解油菜籽饼粕中的硫代葡萄糖苷，结果发现，油菜籽黑芥子酶是较好的降解油菜籽饼粕中硫苷的酶源，虽然油菜籽黑芥子酶活性略低于西兰花黑芥子酶，但其降解产物中腈类、恶唑类等有害物质含量最低。

4.3 形成风味物质

黑芥子酶水解硫代葡萄糖苷产生的次级代谢产物是形成十字花科植物风味物质的主要成分。研究表明，黑芥子硫苷酸钾存在于雪菜中，本身并没有味道，它是雪菜的风味前体物质。在雪菜的腌制过程中，由于植物组织细胞被破坏，使得黑芥子酶与硫代葡萄糖苷接触，水解产生了异硫氰酸酯，具有辛辣味和芳香味。是形成雪菜典型风味的主要物质[59]。另外，芥末和辣根的辣味也是在黑芥子酶作用下产生的异硫氰酸酯类所形成的；榨菜的香味成分比较复杂，但经鉴定其中由黑芥子酶与硫代葡萄糖苷作用下的水解产物所产生的睛类、异硫氰酸酯类等是使榨菜具有其特征香气的主要成分[60-61]。

5 展望

近年来，国内外对黑芥子酶的研究日渐深入，不仅仅是黑芥子酶的结构及性质方面，还有黑芥子酶基因的研究及克隆方面，都取得了大量的研究成果。但在以下两个方面的研究有待加强：

1）酶的活性位点不同导致不同来源黑芥子酶对底物的选择性存在明显差异。酶活性位点结构不同，造成了其在与硫代葡萄糖苷接触反应时，水解的能力存在差异，酶的活力也就不同。因此十字花科植物中黑芥子酶的活性位点的空间结构有待进一步研究。

2）据目前的研究，黑芥子酶主要是从十字花科植物中来提取，工艺比较复杂，产量低，经济效益不高，并不能满足产品生产的需要，迫切需要研究开发新的方法去大量生产所需的酶，比如利用转基因技术构建合适的工程菌等方法。

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The Research Progress of Myrosinase in Cruciferous Plants

SUN Yan-wei1，ZHANG Ze-sheng1，2，3，WANG Tian-xin1，2，*，LI Yu-meng1，QIN Cheng-guang1
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；3.Tianjin Food Safety&Low Carbon Manufacturing Collaborative Innovation Center，Tianjin 300457，China）

Myrosinase exists in cruciferous plants extensively and it catalyses the hydrolysis of glucosinolates.The myrosinase-mediated breakdown products of glucosinolates have been considered as promising compounds for fighting cancer，which has attracted much attention.In this review，myrosinase was firstly overviewed，including its distribution，structure，activity and so on.Then an introduction was made on the methods of myrosinase extraction and myrosinase activity array，followed by outlooks of its application and future direction in the research.

cruciferous plant；myrosinase；glucosinolate；research progress

2016-08-30

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.048

天津科技大学青年教师创新基金（2015lG24）

孙艳伟（1992—），女（汉），硕士研究生，研究方向：天然产物活性成分。

*通信作者：王田心（1985—），男（汉），博士，讲师，研究方向：天然产物活性成分。