食源性致病菌液相芯片高通量快速检测技术的应用进展

党亚丽，周亭屹，么春艳，俞盈

（浙江省医学科学院，浙江杭州310013）

食源性致病菌液相芯片高通量快速检测技术的应用进展

党亚丽，周亭屹，么春艳，俞盈

（浙江省医学科学院，浙江杭州310013）

近年来，食源性疾病已成为当前世界上最突出、最广泛的食品安全问题，致病菌可导致食源性疾病的发生，然而现行的致病菌检测手段已不能满足快速、准确、高通量等要求。液相芯片技术是基于流式细胞技术、酶联免疫吸附技术和传统芯片技术等开发的新一代生物芯片技术和新型蛋白质研究平台，能同时检测多种致病菌。首先对液相芯片的技术原理、特点等进行了简单介绍，接着重点对该技术在食源性致病菌检测中的应用情况进行了总结，同时指出了其在食源性致病菌检测过程中可能出现的问题，最后对该技术的应用前景进行了展望，对有效控制食物中毒事件的发生、食品安全控制、海关进出口检验检疫、临床诊断等具有重要指导意义。

液相芯片；食源性致病菌；检测；应用

近年来，随着社会经济及人民健康水平的发展，食品安全问题越来越受到人们的普遍关注，由病原微生物引起的食源性疾病是目前世界范围内最突出、最广泛的食品安全问题，是影响食品安全的最重要的因素之一[1]。近几年，我国卫生部门通过突发公共卫生事件网络系统收到的食物中毒事件中，微生物性食物中毒事件人数最多，其中大部分是细菌引起的食物中毒，如沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌等。由食源性污染产生的疾病已成为目前危害人们健康的最主要因素之一，开展食源性致病菌的快速检测研究意义重大。

目前，可用于检测和鉴定食源性致病菌的方法主要有传统的培养方法以及一些分子生物学和免疫学方法，如聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫吸附法（ELISA）等。传统的培养方法由于操作繁琐、检测时间长、灵敏度低等原因已被替代。ELISA的检测结果易受多种因素影响，且易出现假阳性。PCR法虽然检测速度快，但检测通量低、操作繁琐[2]。目前较常用的PCR以及ELISA法在实际检测中由于致病菌的种类繁多，进行检测时需多次试验，费时费力。随着现代食品加工和运输速度的加快，对食源性致病菌的检测手段要求快速、灵敏，上述方法已不能满足这些要求。要判断食品中的主要致病菌或对多个食品样本进行同时检测，仍需一种能同时快速检测多种致病菌的方法。有学者研究表明，发展一种能快速准确检测病原体的方法可显著提升食品安全[3]。因此，一种快速、准确检测和追踪病原体和污染物的来源的方法成为当前迫切发展所急需[4]。

20世纪90年代以来分子生物学研究发展迅猛，且多学科融合发展。生物芯片技术是融微电子、生物学、物理学、化学、计算机为一体的尖端新技术，是影响最深远的重大科技进展之一。它通过微加工技术将大量的生物捕获分子（如核酸探针、抗体、抗原等）高密度地排列在特定的载体上，利用生物分子间的特异性亲和反应，实现对基因、配体、抗原等生物活性物质的检测分析，从而达到一次试验同时检测多种疾病或分析多种生物成分的目的。

1 液相芯片技术简介

液相芯片（1iquichip）是美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，是基于xMAP（flexible Multi-Analyte Profiling）技术开发的多功能新型生物芯片技术平台，也称悬浮阵列、微球体悬浮芯片（suspension array，liquid chip）[5-6]。xMAP技术将芯片技术与流式检测有机地结合在一起，集流式技术、荧光微球、激光、数字信号处理和传统化学技术为一体，使生物芯片反应体系由液相--固相反应改为接近生物系统内部环境的完全液相反应体系，实现了高通量检测。xMAP技术是相对灵活、开放，根据待检测生物分子和不同需要进行相应的构建，从而能快速、准确、经济的检测生物分子，被广泛用于制药开发、临床诊断和生物研究。

近年来Luminex公司于1999年研制出第一代Luminex 100液相芯片检测系统，它可同时对1个样本中的100种不同目的分子进行检测。Luminex 200液相芯片检测系统已于2005年研制出，它可根据需要调节探针高度，增强了检测准确性。2007年研制的新一代液相芯片检测平台Flexmap 3D可同时对一个样本中的500种不同目的分子进行检测，且可一次检测384个不同样本。xMAP技术的不断更新使其与传统检验方法相比优点更多，应用范围也更加广泛。

液相芯片技术用荧光染色的方法编码聚苯乙烯微球（微球直径一般为5.6 μm），每种荧光微球均有一个独特的编号。传统的Luminex 100/200技术在微球中加入2种不同荧光素，根据荧光素的比例不同将微球分为100种[7]，而Flexmap 3D技术通过加入3种不同的荧光素，根据荧光素的比例不同可将微球分为500种。然后将每种颜色的微球（或称为荧光编码微球）表面进行不同的化学结构修饰，在其表面上共价交联针对特定检测物的探针、抗原或抗体。将不同荧光信号的微球共价结合不同探针分子后悬浮于一个液相体系中，加入的抗原、抗体等待测物与其充分反应。再在体系中加入标记有另一种荧光信号（一般为绿色）报告分子，这就构成了一个液相芯片反应系统。在检测过程中，通过运用流式细胞技术和激光技术，使微球逐个通过特制通道进行检测。检测系统的激光发射器可以发射两束不同波长的激光，红色激光用于激发微球本身的荧光，用于鉴别微球的种类；另一束绿色激光激发报告分子结合的荧光，并通过检测荧光的强度，用LuminexTM分析软件对被测物进行定量分析[8]。

目前已有的微球主要有5种：MicroPlex微球、SeroMap微球、xTAG微球、LumAvidin微球和MagPlex微球，这些都是在MicroPlex微球的基础上发展而来的[9]。其中SeroMap微球是专门为血清学检测所设计，可减少血清中不同抗体与微球的非特异结合降低背景值。xTAG微球将带有tag的核酸探针与MicroPlex微球连接，可用于核酸检测。MagPlex微球是Luminex公司2007年推出的，又称磁珠（magneticbeads），其最大的特点是带有磁性，使得整个检测过程可自动完成，大大提高了检测速度[10]。

液相芯片技术的优点包括：（1）检测适用范围广：微球表面可包被蛋白、核酸及其他配受体，既能检测蛋白，又能检测核酸，很多生物分子都能用液相芯片进行分析；（2）检测通量高：目前Flexmap 3D技术可对500种靶标分子进行检测，而ELISA每次只能对1种分子进行单一分析；（3）检测灵敏度高：反应过程中微球在液相的条件下悬浮，增加了反应面积，反应时结合的目标分析物多，检测灵敏度高[11-12]；（4）检测速度快：由于微球直径小，混悬于液体中，利于生物分子间的相互作用，从而提高了反应速度，一次分析耗时不到3 h，工作效率高[13]；（5）特异性强：液相芯片技术具有很强的特异性；（6）灵活性好：可根据待检目标分子调整检测体系，选择所需的探针微球系统，灵活性好；（7）检测需要样品量少：液相芯片检测需要的样品量较其他检测手段更少；（8）操作简单：液相芯片技术操作更省时、省力，很多步骤自动完成，减少了不同人之间操作的误差。

目前液相芯片技术由于其高通量、良好的可重复性、高敏感度等特点被广泛应用于病原体检测，遗传性疾病的筛查，基因表达的分析，细胞因子的分析[14-15]。

2 液相芯片技术在食源性致病菌检测中的应用

目前有研究人员将多重PCR和液相芯片技术有效地结合起来，能对多种常见食源性致病菌进行准确的定量检测，且耗时较短（6 h～8 h）。该法对致病菌基因序列进行分析后设计针对这些基因的特异性探针和引物，分别与不同编号的荧光编码微球偶联后再与相应的PCR产物杂交反应，用液相芯片检测仪检测荧光信号，实现了对致病菌的检测，如邱杨等[16]通过该法建立了对沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌的快速液相芯片检测方法，检测灵敏度达到50 copies/mL～100 copies/mL。郭启新等[17]建立了对金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、志贺氏菌的检测方法，具有很好的特异性，检测灵敏度分别达38、44、21 CFU/mL。Sun等[18]用该法建立了高通量的同时检测6种食源性致病菌的方法，检测灵敏度达到了20.4×103CFU/mL，远高于PCR法。

目前还有人用免疫磁珠分离技术将磁珠上包被的特异性抗体，利用抗原抗体之间亲和反应，从成分复杂的样品中快速简便分离目标抗原，再利用磁珠的磁响应性，实现对目标抗原的富集，再结合最新的快速检测技术，实现对食源性致病菌进行检测。Taha等[19]将免疫磁珠分离技术结合科玛嘉的显色培养基检测鸡肉中的沙门菌，该法灵敏度达99%，检测限高达1.6 CFU/mL。Cadirci等[20]利用免疫磁珠分离技术，从200个新鲜牛肉样品和100个牛肉丸样品中分离大肠杆菌0157：H7和0157，再结合多重PCR技术检测毒力基因，达到了检测致病菌和非致病菌的目的。

还有报道通过液相芯片技术对食品中真菌代谢产生的毒素进行定量检测。宋慧君等[21]采用间接竞争法原理和液相芯片技术平台，通过优化偶联抗原浓度，建立了黄曲霉毒素B1液相芯片定量检测方法，灵敏度为2.33 ng/mL（0.116 5 ng）。

3 液相芯片技术在食源性致病菌检测应用中存在的问题

目前许多学者已将液相芯片技术与多重PCR技术结合使用，但基于多重PCR的液相芯片技术对单管样本进行大量不同指标的高通量多重PCR方法建立仍存在困难，至今未见有关液相芯片用于检测超过20种致病菌方法建立的相关报道。在多重PCR制备待检模板过程中，易出现多引物不兼容、探针非特异性结合、交叉杂交、杂交阴性背景高等问题，且不同探针的杂交温度和孵育时间等条件的优化，以及避免不同杂交反应之间的交叉反应等过程节点多，且较繁琐。这些问题限制了在单管中进行高通量的多重PCR，导致无法进行高通量液相芯片检测[22]。

由于抗原靶标的选择特异性要求高，且食源性致病菌的食品基质复杂同样也制约了液相芯片技术的发展。研究者用免疫磁珠对肉品中的致病菌进行分离富集，若不满足高特异性的要求，则富集到很多杂菌，富集到的杂菌会抑制目标菌生长，有时甚至难以富集到致病菌。因此免疫磁珠分离技术若在食源性致病菌检测领域有所发展，仍需进行大量研究工作，筛选到致病菌的特异性抗原靶标[23]。

4 展望

液相芯片技术是一个灵活的操作平台，具有检测准确、可重复性好、信息质量稳定、操作简便、耗时较短等优点。目前该技术已被广泛应用于制药开发、临床诊断和生物研究等方面。在食品卫生检测中，常需对多样品中多种致病菌进行快速检测，将液相芯片技术应用到食源性致病菌检测中，可在短时间内实现对多个样品同时进行多种致病菌检测，因而有望大大提高食源性致病菌检测效率，在有效控制食物中毒事件的发生、食品安全控制、海关进出口检验检疫、临床诊断等方面具有广阔的应用前景。

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Application Progress on the High-flux and Rapid Detection Technolgy of the Suspension Array for the Food Borne

DANG Ya-li，ZHOU Ting-yi，YAO Chun-yan，YU Ying
（Zhejiang Academy of Medical Sciences，Hangzhou 310013，Zhejiang，China）

In recent years，food borne disease has become the world's most outstanding and widely problems in food safety currently.Pathogens can lead to food borne disease.The existing detection methods for the pathogens which lead to food borne disease can not meet the requirements of the fast，accurate and the high flux.There is an urgent need to develop a rapid and accurate method to detect food borne pathogens.Firstly，the paper introduced the principle of the suspension array technology；secondly，the characteristic of the suspension array technology has been summarized；thirdly，it was focused on the application of this technology in the detection of food borne pathogens；at the same time the technical problems that may occur in the process of detection of food borne pathogens were pointed out；finally，the application of this technology was prospected；it had great impor－tance to control the occurrence of food poisoning effectively and the food safety，the customs import and export inspection and the clinical diagnosis，etc.

suspension array technology；food borne pathogens；detection；application

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.045

2016-07-22

浙江省医药卫生项目（201473497）；浙江省科技厅重大科技专项项目（2014c02023）

党亚丽（1978—），女（汉），副研究员，博士，研究方向：生物活性物质及食品安全快速检测。