“低温诱导植物染色体数目变化”实验的探究与思考

邓 琳 李加重

（1天津市静海区瀛海学校 天津 301600 2天津市静海区教育教学研究室 天津 301600）

“低温诱导植物染色体数目变化”实验是人教版高中生物学必修2“染色体变异”一节中的实验内容。该实验的目的是帮助学生理解低温诱导植物细胞染色体数目变化的作用机制，有利于了解染色体变异在实际生活中的应用。但是在实际教学中，按照教材介绍的步骤进行实验时遇到了很多问题，例如成功率低、观察效果不理想等，不利于学生对诱导机制形成直观感受与认知。分析原因，一方面是低温诱导的温度和处理时间的选择存在争议；另一方面是在制作装片的过程中对解离、染色等环节条件的控制有待改进。因此笔者组织学生在实际操作中对该实验进行了进一步的探究和改进。

1 材料与方法

1.1 实验材料 结合教材，实验小组本着实验材料易获得、操作简单、染色体条数少、易观察等原则，确定了几种实验材料：蚕豆（2n=12）、洋葱（2n=16）、豌豆（2n=14）、大葱、大蒜。

1.2 实验方法与步骤

1.2.1 培养根尖 将蚕豆和豌豆种子在清水中浸泡，待种子泡发后放入铺有湿润纱布的培养皿中于室温下培养。因气温较高，培养皿置于无光阴凉处，且每天换水2次。若实验室具备恒温箱，可将培养皿放入10℃中培养，每2天换一次水（水浸没种子的1/3或1/2）。洋葱需在实验前去除老根和干枯的鳞片叶，放入盛有清水的容器中，水以没过洋葱根部为宜，于室温下培养。

1.2.2 低温诱导处理 待实验材料根的长度达到1 cm左右时，将实验材料平均分为3组，分别置于2℃、4℃的冰箱中进行低温处理；对照组于室温下进行培养。低温处理时长控制在36 h（换水时注意用相应温度的水以减少实验误差）。低温处理后恢复常温培养10 h。

1.2.3 材料处理制作装片

1）固定和解离：借助卡诺氏液（无水乙醇∶冰醋酸=3∶1）进入组织和细胞并将其杀死，使其形态结构和内容物尽可能保持完整，还能增强染色体的染色效果。用解离液（15%HCl∶95%酒精=1∶1）去除细胞壁间的果胶使细胞壁软化，并使细胞间中胶层物质溶解便于细胞分离。依据教材实验步骤［1］，取 0.5～1 cm 的根尖（可取 1 cm，便于在之后的操作中取放，在染色时再将多余部分去除）放入卡诺氏液中浸泡。教材要求固定0.5～1 h，解离3～5 min，因考虑解离效果受到自身材料、温度和时长及固定效果的影响［2］，实验小组学生将固定和解离结合考虑，设置多组对比实验。通过不断调整固定和解离的时间发现，固定时间控制在0.5 h对于之后的操作效果更好。固定后的材料用95%的酒精进行充分冲洗，以免影响解离效果。为保证数据准确，固定过程中借助恒温箱将温度设定为25℃，湿度40%。解离效果蚕豆以25～30 min为宜；豌豆15 min为宜；洋葱 10 min为宜（材料保持完整形态，染色时可被捣碎，压片时盖上盖玻片即可将材料压碎使细胞分散开）。解离时间不足会导致压片不能成雾状、细胞不能充分分散重叠度高、染色不充分等情况。

2）漂洗：依据教材介绍的实验步骤，解离后使用清水对实验材料进行漂洗以去除残留的解离液，防止解离过度。注意应漂洗3次，每次2～3 min，且注意动作力度，防止破坏根尖形态。

3）染色：可选染液包括龙胆紫、醋酸洋红和改良苯酚品红溶液。本次实验选择龙胆紫（缺点在于易对细胞质染色，染色体观察不清，增大观察难度）和醋酸洋红（缺点在于配制复杂，购买配制好的染液价格昂贵）。采取2种染色方法，其一将实验材料浸泡在染液中3～5 min；其二在载玻片上滴一滴清水，将已漂洗的实验材料置于清水中，滴加一滴染液，再用镊子将根尖轻轻捣碎至组织分散，染色 2 min［3］（通过比较，学生发现第 2 种方法染色更快、更均匀）。

4）盖上盖玻片，在盖玻片上铺吸水纸并加一层载玻片，轻轻按压，注意力度。也可用镊子钝头轻轻敲打盖玻片下的材料，使材料分散成雾状。用高倍镜观察细胞的染色体情况。

2 实验结果

2.1 洋葱和蚕豆实验效果的比较 实验操作中发现，蚕豆根尖因培养时间较长、根比较粗壮、细胞质丰富等原因，使得现有实验条件下不利于染色体数目的观察。豌豆根尖质地坚硬，不易制作压片。与前2种材料相比，洋葱根的培养时间较短、分裂旺盛、便于染色观察。根据实验结果观察，洋葱试验比较容易获得对比度较好的染色体（染色质）染色效果。

2.2 洋葱根尖于龙胆紫、醋酸洋红染液染色效果的比较（图1、图2，本文附图见封四）。

如图可见，0.02%龙胆紫染液较0.01%龙胆紫染液染色效果深，影响染色体（染色质）观察，醋酸洋红染液染色效果清晰、明亮，可清晰地观察到细胞中染色体（染色质）的分布情况。

2.3 蚕豆、洋葱根尖在不同处理条件下的实验结果

1）蚕豆在 2℃、4℃条件下培养36 h，然后在室温培养10 h，随后镜检，分析实验效果（图3）可见，细胞分裂的中期和后期，部分细胞大小和染色区域面积明显较大。因染色条件不易把握，不易观察到清晰的分裂前期图像和染色体数量加倍的现象。

2）洋葱根尖 2℃、4℃条件下培养 36 h，然后在室温培养10 h，随后镜检。结果（图4、图5）显示，2种温度诱导处理后再进行常温培养的根尖，细胞分裂均比较旺盛，少数细胞出现染色体数目加倍的现象。其中，4℃条件下能观察到根尖细胞分裂更旺盛，说明洋葱在这样的诱导条件下实验效果相对更好。

3 讨论和分析

本次实验在实验前学生按教材过程进行实验操作，针对操作中发现的问题对实验过程进行了分析和讨论，并分组进行实验设计。针对实验材料、原理、自变量和因变量进行了设定，例如以温度为自变量，以诱导时间为自变量等。

3．1 对低温范围的设定 在操作中要将温度控制在多少度才能更好地使植物细胞发生染色体数目变化？教材中要求将温度设定在4℃，但学生对“低温”这一概念存在许多疑问。在进行低温诱导研究时，通过分组实验，学生将温度分别控制在2℃、4℃。对于学生提出的为何不能将温度设置在零下，笔者保留了问题，要求学生参考低温诱导染色体加倍和酶活性原理查阅相关资料进行思考。学生经实际培养发现，0℃诱导条件下根尖出现冻害变黑、变软，不能用于镜检。

3.2 对低温处理时间的探究 学生通过查阅低温诱导植物染色体数目变化的原理可知，低温阻碍细胞内酶促反应的进行，从而导致细胞分裂时纺锤体的形成途径受阻，以致影响子染色体被拉向细胞两极，使细胞不能分裂成2个子细胞，于是植物细胞染色体数目加倍。观察染色体数目的最佳时期是细胞分裂的中期。因此，要在低温条件下处理多长时间成为另一个重要问题。学生讨论得出答案：只有当细胞分裂进入到第2个细胞周期的中期时才能确保观察比较低温诱导染色体数目变化是否成功。因此低温处理时长至少需要长于1个细胞周期。其次，低温降低酶的活性，细胞代谢水平整体下降，分裂速度变缓，使得细胞周期延长。笔者提供常温下蚕豆根尖的细胞周期为17.3 h［4］，洋葱根尖的细胞周期大于12 h，因此，实验小组决定按教材要求将低温处理时间设定为36 h。

3．3 实验中如何确定染色体数目发生变化的细胞 为便于比较细胞中染色体数目是否发生变化，进行常温培养对照实验，用以观察不经低温诱导的根尖分生区细胞中染色体数目及分布情况。但在实际观察中很难数清染色体条数。

在实验装片的观察中，学生发现某些细胞中存在2个距离很近且清晰的细胞核（图6、图7），不同于分裂末期的细胞。学生提出质疑后，笔者组织学生对比观察对照组材料装片和实验组装片，设置表格记录双核细胞出现的频率。比较发现只有实验组装片存在这一现象，就此问题学生深入思考双细胞核形成的原因。经查阅资料和分析得出，低温诱导过程中细胞分裂并未阻断细胞的分裂行为而使分裂停止在前期或中期。由于低温使纺锤体装配组件受到影响，使分开的染色单体不能拉向细胞两极，也未形成2个子细胞。对于已经进入后期但染色体未到达两极的细胞来说，子染色体将停止运动随后形成2个新的细胞核，同时低温影响细胞质分裂2个子核保留在同一个母细胞中［5］。学生提出可利用双核细胞作为“低温诱导细胞染色体数目变化”的实验辅助观察指标，提高实验的成功率。

3．4 实验中一些细节问题 实验小组学生通过实验发现，经过低温处理的根尖直接进行实验，可观察到的进行细胞分裂的细胞较少。分析原因可能是低温处理后，细胞未能进入新的分裂期，即出现细胞同步化［6］。针对这一问题，选择在低温诱导后恢复常温培养使细胞分裂再次进行。恢复常温培养的时间严格控制在实验材料的1个细胞周期以内即10 h，从而使低温诱导后的细胞再次出现一个细胞分裂的高峰。

细胞分裂在24 h内旺盛程度不同，考虑细胞分裂于上午10时至下午14时较旺盛，选择将放入冰箱进行低温诱导的时间定为上午10时。对诱导处理后的细胞进行实验观察也应将时间选择在上午10时左右进行。

4 结论

本实验通过学生分组探究，对“低温诱导植物染色体数目的变化”实验中的一些细节进行了补充，对固定、解离、染色等常规操作步骤做了更详细的处理，以提高实验的成功率。染色体观察效果证明，虽然蚕豆的染色体数目少、细胞大，但在高中实验中洋葱相比于蚕豆、豌豆等实验材料更理想，具有操作简单、解离时间短、染色体染色效果清晰等优点。根据实验，醋酸洋红染色较龙胆紫更易获得对比度高的染色体(染色质)图像；考虑使用安全和经济条件等因素，可使用0.01%龙胆紫染液。

需要说明的是，蚕豆、洋葱等都是经过许多人探索，适于教学实验的材料；龙胆紫、醋酸洋红等均被长期用于染色体显色实验。有经验、有水平的实验者均可利用这些材料、方法获得高质量实验结果。所以，这里仅从探究角度进行分析，所获的经验在同等条件下具有参考价值和教学意义，但不试图无条件推广。相反，同行在此基础上的进一步改进（甚至纠偏）一定更有价值。

本实验仍有许多改进之处。例如：将实验的诱导温度和时间进行更细化处理；在处理实验结果时，可通过列表对细胞分裂指数进行计算和比较，从而更准确探究更好地诱导染色体数量变化的条件。笔者将进一步尝试，并组织学生设置后续实验方案，继续探究。

本次实验在教师的引导和提示下，学生充分参与实验的探究和思考，更好地体现了学生的主导地位，从而培养学生的实验思维和实验能力，逐步养成不断质疑、不断研究的学习习惯。

［1]人民教育出版社，课程教材研究所，生物课程教材研究开发中心.生物：必修2.北京：人民教育出版社，2007.

［2]郁建强，陆文初.植物细胞有丝分裂实验技术的改进.实验室研究与探索，2001（6）：70.

［3]林荔，肖义军，詹晓梅.低温诱导植物细胞数目变化实验的改进.中学生物学，2012，28（1）：45.

［4]顾文波.细胞周期与细胞同步化.生物学教学，2011，36（6）：54.

［5]利荣千.植物细胞学专题讲座：第2讲：植物细胞周期与细胞的异常分裂.湖北农业科学，1980（8）：35.

［6]周爱文，柯铁，梅兴国.低温诱导红豆杉细胞同步化的研究.武汉化工学院学报，2001，34（1）：12.