降血压肽研究进展
2017-04-08许伟瀚双全吴楠
许伟瀚,双全,吴楠
(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特010018)
降血压肽研究进展
许伟瀚,双全*,吴楠
(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特010018)
公众早已重视高血压病的防治,降血压肽以其高效的降压效果且无毒性、无副作用,受到人们的广泛关注。综述近年来降血压肽的研究进展,希望为降血压肽的进一步研究提供依据,为预防和治疗高血压提供新的选择,为降压药物或功能性食品的产业化生产提供理论参考。
降血压肽;作用机理;制备;活性检测
高血压作为冠心病、外周动脉疾病及中风重要诱因,严重危害着人类的健康,在西方国家平均每三人就有一人受到高血压的威胁[1]。高血压是最常见的流行病和心血管疾病之一,与人类多种脏器并发症有紧密联系,研究表明,人体血压水平与心血管疾病的发病几率有直接关系[2]。血管紧张素转化酶(Angiotensin-IConverting Enzyme,ACE)抑制剂,又称为降血压肽(Antihypertensive Peptides),是一类具有显著降血压作用的多肽。说起降血压肽,必须提到的科学家是Ferreira,他和助手在1965年首次从蛇的毒液中提取到具有降血压活性的多肽,引起了世界各地研究者对降血压肽的研究兴趣。据报道,很多发达国家早已尝试化学合成ACE的抑制剂并在临床治疗中使用[3]。然而,化学合成的降压药物往往会引起皮疹、喉咙肿痛、味觉系统失调、肾脏损害等各种副作用,不适合长期连续服用[4-6]。食源性降血压肽与化学合成的降血压药物相比,具有无副作用、吸收好、并且仅对病理性高血压患者有降压效果等优点。
研究表明,已经可以从动物蛋白、植物蛋白、微生物代谢产物中分离提取降血压肽[7-9]。广泛的来源、安全无毒以及显著有效的降压效果,使降血压肽的研究开发成为国内外功能性食品领域一个热点问题[10-12]。本文通过对降血压肽的作用机理以及近年来的制备方法、活性检测的综述,加强对食源性降血压肽的认识,也为食源性降血压肽的理论研究和产业化提供进一步的理论参考。
1降血压肽作用机理
肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System,RAS)和激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-Kinin System,KKS)是维持人体血压平衡的重要因素。在RAS系统中,血管紧张素原是一个限速底物,当人体循环血量或肾血流量因疾病或失血减少时,会促使肾小球旁器生成肾素进入血液,将肝分泌的血管紧张素水解为血管紧张素I(Angiotensin-I,Ang-I)。然后,原来无活性Ang-I在ACE的作用下,C末端组氨酸残基被切除,转化为血管紧张素II(Angiotensin-II,Ang-II)。Ang-II作用于血管平滑肌,有很强的血管收缩功能,过多的分泌会引起全身小动脉收缩过度,血压升高。AngII会同时刺激肾上腺皮质分泌醛固酮作用于肾小管,保钠、保水、排钾,导致Na+浓度增加、血量增多,使血压升高。KKS系统中的舒缓激肽属于激肽系统,其前体物质是血浆蛋白α-球蛋白中的舒缓激肽原。舒缓激肽有B1和B2两种受体,其中,B2受体具有高亲和力、易饱和的特点,激活后可使内皮细胞内Ca2+浓度上升,进而激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthases,NOS)产生NO。NO是一种内皮衍化舒张因子,具有强力的平滑肌舒张作用,使血管松弛,改变毛细血管通透性,导致血压下降。ACE会切除舒缓激肽C端的氨基酸Phe-Arg,研究认为,Phe-Arg是舒缓激肽的活性位点,切除后导致其失活,从而使KKS系统丧失降压功能。所以,ACE会通过双重作用提高血压,即刺激血管收缩和抑制血管舒张。
ACE是金属肽酶,其2个结合Zn2+位点是ACE反应的活性基团部位。降血压肽是对ACE活性区域亲和力较强的竞争性抑制剂,与ACE活性中心中的Zn2+结合,亲和力比AngI和舒缓激肽强,不易从结合区释放,从而使ACE失活,恢复升压系统和降压系统对血压调控的平衡。
2降血压肽的制备方法
2.1酶解法
目前酶解法是制备降血压抑制肽的主要途径[13]。酶解法具有专一性强、副产物少、反应条件平和、效率高以及容易控制等优点。其缺点为原料的蛋白质一级结构一般是未知的,且具有降血压活性的多肽没有固定结构,所以酶解法存在一定的盲目性[14]。因此,酶解法制备降血压肽研究重点和热点主要是特异性酶和高效天然蛋白质原料的选择[15]。目前常用的酶有:胃蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胶原蛋白酶等。
周晓晴等[16]用鲫鱼加工下脚料为原料,利用酶解法制备ACE抑制肽,以ACE抑制率为指标,筛选出胃蛋白酶为最适酶解蛋白,确定最佳酶解条件为:加酶量[E]/[S]=521U/g、酶解时间5.3 h、料液比1∶4.4(g/mL)。以最优条件制备的ACE抑制肽实际抑制率达到75.79%,与理论预测值76.17%无较大差距。
Alan Connolly等[17]以啤酒糟为原料,用不同蛋白酶对其进行水解,使用超滤法和高效液相色谱与质谱联用法分离、分析,得到32种多肽,经鉴定有12种多肽具有降血压活性,其中IVY和ILDL活性最高,ACE的IC50值分别为(80.4±11.9)μmol/L和(96.4±8.36)μmol/L。
贾叶叶等[18]以沙漠果为原料,采用响应面分析法优化沙漠果蛋白ACE抑制肽酶解制备的技术条件。确定碱性蛋白酶的最佳酶解条件为:酶添加量2000U/g,酶解时间114min,酶解温度57℃,底物浓度3.24%,初始pH 10,以最优条件制备的ACE抑制肽实际抑制率为69.83%。
Miguel Angel Sentandreu等[19]以腌肉为原料,使用骨骼肌中分离的二肽酶水解,得到11种降血压肽,经鉴定,ACE抑制活性最强的是Val-Tyr,IC50为(4.6± 0.2)μmol/L。
Rafik[20]等以乌贼肌肉为原料,用多种蛋白酶水解,利用葡聚糖凝胶层析法和反相高效液相色谱法分离得到3种具有降血压活性的多肽,经鉴定,ACE抑制活性最强的是Met-Ala-Trp,IC50为16.32μmol/L。
Tsai等[21]以文蛤肉为原料,用复合蛋白酶水解,得到具有ACE抑制活性的二肽,氨基酸序列为Tyr-Asn,其IC50为51μmol/L。
李景等[22]以豆粕为原料,利用复合蛋白酶分步水解。首先使用碱性蛋白酶水解,酶添加量5 100U/g,反应pH 9,酶解时间2 h;再使用胰蛋白酶水解,酶添加量950U/g,反应pH 8,酶解时间2 h。经测定,酶解产物的ACE抑制率为72.21%。
伍强[23]等采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步酶解鲍鱼性腺蛋白,采用正交实验和响应面分析法优化制备工艺参数。研究表明,第1步碱性蛋白酶最佳工艺参数为:酶添加量0.5%、酶解时间6 h、酶解温度55℃、反应pH 8.5;第2步木瓜蛋白酶最佳工艺参数为:酶添加量1.5%、酶解时间36min、酶解温度57℃、反应pH 6.5。利用凝胶过滤色谱法测得超滤组分中,分子质量在1 ku以下的小肽含量为98.5%,IC50为0.44mg/mL。
此外,有研究证明,对原料蛋白进行适当的预处理可以提高蛋白水解液的ACE抑制率。黄丹丹等[24]利用酸、碱、热、超声、超高压五种预处理方式对胶原蛋白进行处理,实验证明碱和超声处理组的胶原蛋白水解液ACE抑制率高于未处理组。根据胶原蛋白的构效关系,这两种预处理方式可能有利于胶原三螺旋区位点的暴露。
2.2 发酵法
发酵法是利用微生物代谢过程中产生的酶,水解原料中蛋白质,再从发酵液中提取具有ACE抑制活性的多肽[25]。提取原理为:在高浓度的盐溶液里,盐离子竞争性的结合蛋白表面的水分子,破坏蛋白表面的水化膜,溶解度降低,蛋白质在疏水作用下聚集形成沉淀。每种蛋白质的溶解度不同,因此可以用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。硫酸铵的溶解度大,解离形成大量的NH4+、SO42-离子,会结合大量的水分子,使蛋白质的溶解度下降,另外,其温度系数小,不易使蛋白质变性。因此,发酵法常选用硫酸铵盐提取活性多肽。
吕卉卉等[26]研究发现通过发酵瑞士乳杆菌,可水解乳清蛋白产生有效的降血压肽。研究表明,最佳技术条件为:乳清质量浓度114.1 g/L、发酵时间17.52 h、发酵温度37.07℃。在最佳工艺参数下,ACE抑制率为89.337%。
Nejati等[27]以新鲜牛乳为原料,使用Lactococcus lactis DIBCA2进行发酵,再利用反向高效液相色谱分离发酵乳中的多肽,测得IC50为5μg/mL。
Nakahara等[28]通过改良酱油发酵工艺制得发酵酱油(FSS),其总肽浓度比常规发酵酱油高2.7倍,纯化后得到10种ACE抑制肽,其中活性最高的肽序列为Ala-Trp,IC50为10μg/mL。
2.3自溶法
自溶法是将原料置于一定条件参数下,使原料细胞的溶酶体膜破裂,溶酶体中的水解酶释放到细胞中,酶解自身蛋白质,得到具有降血压活性的多肽。自溶法制备降血压肽的缺点有原料来源少,提取效率低等,因此,即使该方法提取的降血压肽比较理想,在实验室有一定的研究与应用,但仍难以将自溶法应用到降血压肽的工业化生产。
2.4基因工程法
基因工程法,又叫做重组法,是指结合工程菌,利用基因工程手段发酵制备ACE抑制肽,避免了传统酶解法制备ACE抑制肽的缺点,工艺相对简单,产量增高、成本减少,对于实现产业工业化有重要意义[29]。
孙海燕[30]等对纯化得到的3种具有较好降血压活性的多肽(VLPVP、KVLPVP和VLPVPR)进行重组高效表达的研究,并进行体外试验。实验结果表明,3种重组多肽的降血压活性都比较理想,和国内外文献描述一致,对血压正常大鼠无降压活性。
Hasan M D等[31]利用基因工程法将降血压肽基因转移至表达载体,使多肽基因以串联多聚体形式表达,提高了多肽基因表达量和结构稳定性。再利用反相液相色谱法和免疫亲和层析进行纯化,经过模拟胃液水解后ACE抑制活性没有发生明显变化,IC50为2μmol/L。
3降血压肽的活性检测
研究开发食源性降血压肽的关键是设计简便有效的ACE抑制活性的检测方法。目前,降血压肽的活性检测程序主要包括体外试验、体内试验、临床验证。
3.1体外试验
体外试验主要有紫外分光光度法[32-33]、高效液相色谱法[34-35]、荧光法[36]、毛细管电泳法[37-38]。目前采用较多的是1971年Cushman等设计的紫外分光光度法。该方法的原理是利用马尿酰组氨酸亮氨酸(Hip-His-Leu,HHL)作为AngI的模拟物,根据降血压肽的作用机理,ACE催化分解该模拟物生成马尿酸(Hippuric Acid,Hip),Hip在波长228 nm处具有特征吸收峰,当HHL的量一定时,ACE的活性与Hip的生成量成线性关系。降血压肽抑制ACE的活性,阻碍其分解模拟物,使Hip的生成量减少。通过测定加入降血压肽前后Hip的OD值,利用公式可算出IC50。但是,该方法需要用乙酸乙酯将Hip萃取后才能进行检测,在萃取过程中一部分HHL也被萃取出来,导致结果偏高[39]。
3.2体内试验
体外试验活性很高的降血压肽,经过消化道内酶的分解后,一些具有活性的物质可能会被降解而失去活性,因此,体内试验是评价降血压肽效果的必要方法[40-41]。
动物试验可分为两类,一类是以自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive rats,SHR)为试验对象,通过静脉注射或口服不同剂量的降血压肽,与对照组比较不同剂量的降血压肽对血压的影响;另一类是对麻醉后的大鼠静脉注射六甲铵,再给其注射降血压肽,通过与对照组比较,探讨降血压肽的活性[42]。
王茵[43]等以紫菜为原料,用中性蛋白酶水解,超滤分离出有效的降血压肽组分并设计体内试验,利用BP-6动物无创血压测试仪测定该降血压肽对SHR和正常血压的大鼠(Wistar Kyoto rats,WKY)血压水平的影响,并与化学合成药物卡托普利作比较。试验分为低剂量组、中剂量组和高剂量组,在2 h~6 h血压下降至最低值,随后开始回升,在8 h内有持续的降压效果。试验表明,该降血压肽对SHR具有持续显著的降压效果。
Lee等[44]以金枪鱼组织蛋白为原料,分离出有效的降血压肽并进行体内试验,试验剂量为10mg/kg·bw,以化学合成药物卡托普利作阳性对照,口服6h后试验组和对照组血压下降幅度最大,分别为21、26mmHg。
翟爱华[45]等观察米糠蛋白ACE抑制肽对SHR的降压效果,并与卡托普利的降压效果进行了比较。对SHR大鼠采用灌胃的方法给予米糠蛋白ACE抑制肽,2 h后血压下降幅度达到最大值(31±6.8)mmHg。
Chen等[46]观察米渣蛋白水解物中获得的ACE抑制肽对SHR的降压效果,以卡托普利作阳性对照,在灌胃1 h后出现最大血压下降幅度,下降了28mmHg。
体内试验成本高,试验周期长。因此,对于降血压肽的活性检测来说,一般先通过体外试验进行低成本、高通量的预筛选,再进行体内试验,实现降血压肽产品的开发利用。
3.3临床验证
降血压肽生物活性的最终评价依赖临床验证。通常方法是将高血压患者随机分为两组,一组为试验组,另一组为对照组,在测定每人血压基准值的前提下进行试验。试验组按照试验设计参数,每日定时定量摄入待验证的降血压肽;对照组进行和试验组相同的饮食、运动量等生理活动,但不摄入降血压肽。通过每日定时测定全员血压水平并进行对比及误差分析,根据数据结果,可以得出临床验证结论[47]。食源性降血压肽的临床验证在国内少见论述,但尚未出现负面效果的报道。
4展望
近年来,国内外学者对食源性降血压肽进行了大量的研究,每年都有数量众多的新型、有显著ACE抑制活性的降血压肽被发现。与化学合成降血压药物相比,食源性降血压肽具有高效的降压效果、无毒性、无副作用等优点,且对血压正常者无不良影响。同时,降血压肽作为一种生物活性多肽,还可以调节人体新陈代谢、免疫功能,延缓衰老。我国对于食源性降血压肽的研究起步较晚,但我国具备广泛的降血压肽提取来源,且分离纯化技术也日益成熟。目前的研究热点主要集中在降血压肽的降血压分子机制、体内外生理活性检测、低成本制备技术,以及其构效关系上。随着国内外学者的深入研究、实现食源性降血压肽的工业化生产,未来降血压肽定能成为高血压疾病防治的一种有力手段。
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Progression of Antihypertensive Peptides
XUWei-han,SHUANGQuan*,WUNan
(Collegeof Food Science and Engineering,InnerMongolia AgriculturalUniversity,Huhhot010018,InnerMongolia,China)
The prevention and cure of hypertension had drawn public attention.Antihypertensive peptides earned people's concern because they had good effecton blood pressure regulation and no other side effects.In thisarticlewe give a review on recently study of Antihypertensive peptides,anticipating to give a reference for further research.Itwillbe an theoretical reference for antihypertensive peptides industrial production,and provide new options forhypertension prevention and treatment.
antihypertensivepeptides;mechanism source;preparation;activitydeterminationmeans
10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.047
2016-06-15
国家自然科学基金(31460443);内蒙古自治区自然科学基金(2016MS0338)
许伟瀚(1993—),男(汉),硕士研究生,研究方向:食品微生物。
*通信作者:双全(1964—),男(蒙古),教授,博士,研究方向:食品科学。