高效液相色谱-串联质谱快速测定饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物残留

魏云计，朱臻怡，冯 民，何 健，沈金荣，何正和，秦 娴，张伶俐，钱怡平，丁 涛

(1.淮安出入境检验检疫局 国家饲料安全检测重点实验室(淮安)，江苏 淮安 223001；2.江苏出入境检验检疫局 动植物与食品检测中心，江苏 南京 210001 )

高效液相色谱-串联质谱快速测定饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物残留

魏云计1*，朱臻怡1，冯 民1，何 健1，沈金荣1，何正和1，秦 娴1，张伶俐1，钱怡平1，丁 涛2

(1.淮安出入境检验检疫局 国家饲料安全检测重点实验室(淮安)，江苏 淮安 223001；2.江苏出入境检验检疫局 动植物与食品检测中心，江苏 南京 210001 )

建立了高效液相色谱-串联质谱快速测定饲料中甲硝唑(MNZ)、甲硝唑代谢物(MNZOH)、二甲硝咪唑(DMZ)、二甲硝咪唑代谢物(HMMNI)、洛硝哒唑(RNZ)、异丙硝唑(IPZ)、异丙硝唑代谢物(IPZOH)残留的分析方法。样品经0.1 mol/L pH 8.0磷酸盐缓冲液和乙酸乙酯-丙酮(70∶30)提取，提取液经分散型固相萃取填料N-丙基乙二胺(PSA)净化后,再经正己烷脱脂，液-液分配净化，采用电喷雾电离源(ESI)正离子多反应监测(MRM)模式检测，氘代同位素内标法定量。该方法省去耗时的固相萃取过程，快速、简单、高效，7种目标分析物在2.0～100.0 μg/L 范围内线性关系良好，相关系数大于0.99，在5.0～25.0 μg/kg范围内，3个加标水平的回收率为72.4%～95.6%，相对标准偏差(RSD)均小于12.5%；检出限为2.5 μg/kg，定量下限为5.0 μg/kg。

高效液相色谱-串联质谱；饲料；硝基咪唑类；代谢物

硝基咪唑类药物是一种具有5-硝基取代咪唑杂环结构的化合物，常用的药物主要有甲硝唑、二甲硝咪唑、异丙硝唑和洛硝哒唑等。此类药物具有抗菌和抗原虫作用，能杀灭和预防厌氧菌和病原虫，可用于治疗和预防家禽的滴虫病和球虫病、猪密螺旋体性痢疾及动物的各种厌氧菌感染。研究发现硝基咪唑类药物具有潜在的致癌、致畸和致突变性[1-2]，因此欧盟、美国等国际组织和我国禁止在动物源性食品中使用此类药物[3-4]。为保障动物源性食品安全，从源头控制可食用动物对硝基咪唑类药物的摄入，有效解决动物源性食品中硝基咪唑类药物残留问题，因此研究饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物检测的方法具有重要意义。

目前，关于动物源性食品、蜂产品及化妆品中硝基咪唑类药物的残留检测方法报道较多，主要有酶联免疫吸附法[5]、毛细管电泳法[6]、气相色谱法(GC)[7]、高效液相色谱法(HPLC)[8-11]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[12-16]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[17-23]等。HPLC和GC的灵敏度低，抗干扰能力差，对多组分物质同时测定无法准确定性定量分析；GC-MS的灵敏度虽然高，但需要衍生化，产生干扰物质多，操作繁琐；LC-MS/MS的灵敏度高，选择性和抗干扰能力强，被广泛应用于硝基咪唑类药物及其代谢物残留分析，并适用于对成分复杂、基质干扰较大样品的更准确的定性、定量分析。

饲料中硝基咪唑类药物残留的分析方法目前已有报道，其前处理过程均使用固相萃取技术去除基质干扰，使得实验过程繁琐、周期长、成本高，并对环境污染大；关于饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物残留同时测定的液相色谱-串联质谱法尚未见报道。在已有文献基础上，本文优化了前处理提取方法，采用基质分散固相萃取填料N-丙基乙二胺(PSA)净化，正己烷脱脂，液-液分配净化技术，结合液相色谱-串联质谱的强选择性和抗干扰能力，建立了饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物残留的快速定性定量方法。该方法的灵敏度高，无需固相萃取净化，实验周期短，提高了工作效率，方法定量下限可满足国家残留监控的要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo Finngan TSQ Quantum Ultra EMR串联质谱仪，配有电喷雾离子源(ESI)；C18柱(150 mm×2.1 mm i.d.,3.5 μm ,Agilent公司)。甲醇(德国Merck公司)、甲酸(美国Tedia公司)、乙酸铵(美国ACS恩科公司)均为色谱纯，乙酸乙酯、正己烷、丙酮、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾(南京化学试剂股份有限公司)均为分析纯，实验用水为去离子水。甲硝唑(MNZ)、甲硝唑代谢物(MNZOH)、二甲硝咪唑(DMZ)、二甲硝咪唑代谢物(HMMNI)、洛硝哒唑(RNZ)、异丙硝唑(IPZ)、异丙硝唑代谢物(IPZOH)、氘代二甲硝咪唑(DMZ-D3)、氘代二甲硝咪唑代谢物(HMMNI-D3)、氘代异丙硝唑代谢物(IPZOH-D3)标准品均购自Dr.Ehrenstorfer GmbH，纯度≥98%，用甲醇溶解并配制成1.0 mg/mL标准储备液，再根据需要稀释成适当浓度的混合标准工作液，4 ℃避光保存。

1.2 样品前处理

称取(1.00±0.05) g 饲料于50 mL 具塞离心管中，加入4 mL 0.1 mol/L pH 8.0磷酸氢二钾缓冲液，涡旋混匀30 s后待饲料浸润，加入10 mL乙酸乙酯-丙酮(70∶30)混合溶剂，于涡旋混合器上快速混匀30 s，超声波提取10 min；以8 000 r/min的速率离心5 min，转移上层有机溶液至50 mL具塞离心管中，加入PSA粉末0.15 g，混匀30 s，静置后转移有机溶液至50 mL鸡心瓶中，于40 ℃水浴中减压浓缩至干，准确加入1.00 mL甲醇-水(30∶70)混合溶液，涡旋后再加入0.5 mL正己烷涡旋，转移至1.5 mL离心管，12 000 r/min离心1.5 min，取下层溶液过0.22 μm有机滤膜于进样瓶中，供仪器分析。

1.3 液质联用仪分析条件

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(150 mm×2.1 mm i.d.,3.5 μm )；流动相：A为 5 mmol/L乙酸铵水溶液，B 为0.1%甲酸甲醇溶液；梯度洗脱程序：0～3.0 min ，90% A；3.0～4.5 min，90%～35% A；4.5～5.0 min，35%～10% A；5.0～7.0 min，10% A；7.0～7.5 min，10%～90% A；7.5～9.5 min，90%A；流速：250 μL/min；进样量：25 μL；柱温：30 ℃。

表1 硝基咪唑类药物多反应监测模式的质谱参数Table 1 MS/MS parameters in multiple reaction monitoring(MRM) mode for nitroimidazoles

*quantitative ion

质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，喷雾电压：3 000 V，离子源温度：400 ℃，鞘气：45 bar，辅助气：10 bar；离子传输管温度:350 ℃；多反应监测(MRM)方式检测，优化质谱条件见表1。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的优化

硝基咪唑类药物及其代谢物的极性较强，常用的提取溶剂主要有甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和三氯甲烷等有机溶剂。由于二氯甲烷和三氯甲烷的毒性较强，一般不采用；甲醇、乙腈的极性较强，提取效率较高，但提取的基质干扰物较多，基质抑制效应明显；乙酸乙酯极性较弱，对极性较强的甲硝唑代谢物提取效率低。考虑到硝基咪唑类药物的极性及对温度有一定的敏感性，实验选用沸点低、极性相对较强的乙酸乙酯-丙酮混合溶剂作为提取溶剂，以降低提取液在浓缩过程中温度和时间对回收率的影响。实验对混合溶剂中乙酸乙酯和丙酮的不同体积比(9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5)进行优化，在阴性猪饲料中添加50.0 μg/kg混合标准溶液，测定其绝对回收率(n=3)，结果表明，采用乙酸乙酯-丙酮(7∶3)作为提取溶剂时，几种硝基咪唑类药物可以获得最佳回收率。

硝基咪唑类作为一种碱性化合物，在碱性条件下呈游离分子态，为了使目标分析物有效地从饲料基质中提取出来，以提高绝对回收率，实验加入了磷酸氢二钾缓冲液，使溶液呈碱性。饲料基质中直接加入乙酸乙酯-丙酮(7∶3)溶剂提取的绝对回收率为36.1%～42.3%；而加入磷酸氢二钾缓冲液后，再用乙酸乙酯-丙酮(7∶3)溶剂进行液-液分配萃取，可去除部分亲水性杂质，提取的绝对回收率为43.1%～58.9%。故实验采用磷酸氢二钾缓冲液润湿样品，使溶液呈弱碱性，再用乙酸乙酯-丙酮(7∶3)混合溶剂提取。

2.2 净化条件的优化

乙酸乙酯-丙酮(7∶3)溶剂对硝基咪唑类药物的提取效率较高，但提取的脂性干扰物较多，需要进一步净化。本实验比较了固相萃取小柱HLB、MCX和分散型固相萃取填料PSA的净化效果，发现HLB小柱、MCX小柱和PSA填料均有较好的富集净化作用。采用HLB和MCX小柱净化时，先采用有机溶剂提取目标物、浓缩后，分别采用0.1 mol/L磷酸溶液溶解目标物再净化，过程复杂，经过两次浓缩，目标物损失较多。由于PSA填料的主要成分是N-丙基乙二胺，能与饲料中的一些酸性化合物结合以去除基质中的酸性干扰物，提高了回收率。同时饲料中脂肪含量较高，样品经过有机溶剂提取后，提取出较多脂肪，PSA填料不能有效将其去除，而在样品定容后采用0.5 mL正己烷溶液进行液-液分配萃取净化去除脂肪，可达到较好的净化效果。故本实验采用固相萃取填料PSA和正己烷液-液分配萃取净化技术，替代固相萃取小柱净化，操作简单，减少了有机溶剂的消耗，缩短了样品前处理的时间，提高了工作效率。

2.3 浓缩条件的优化

硝基咪唑类药物的热稳定性不好，本文对提取溶剂浓缩方式进行优化，考察了浓缩温度40 ℃条件下，旋转蒸发仪、平行蒸发仪、氮吹仪3种不同浓缩方式对回收率的影响。实验发现，经过上述3种浓缩方式处理后的绝对回收率依次为43.1%～58.9%，39.2%～56.4%，38.6%～55.7%，回收率略有降低；由于采用旋转蒸发仪浓缩处理的时间最短，目标物受温度影响最小，浓缩效率和回收率最高，故本文采用旋转蒸发仪对提取液进行浓缩。

图1 饲料中添加硝基咪唑类药物(5.0 μg/kg)及内标(20.0 μg/L)的MRM色谱图Fig.1 Multiple reaction monitoring(MRM) chromatograms of nitroi-midazoles(5.0 μg/kg) and internal standard(20.0 μg/L) spiked in feed sample

2.4 基质效应、线性范围、检出限与定量下限

饲料基质较为复杂，实验发现目标物在基质中存在明显的基质干扰现象。取空白基质溶液和定容溶液分别配制成浓度为50 μg/L的混合标准溶液，按照本方法进行测定，以基质溶液配制目标物的峰面积/无基质溶液配制目标物的峰面积×100%来评价基质效应。其中，基质效应数值越大，表明受基质影响越小；数值越小，表明受基质影响越大。数据显示各目标物均存在不同程度的基质效应(见表2)，同时由于各目标物无法采用一一对应的同位素内标物进行定量消除基质效应，因此本文采用基质标准曲线以降低基质效应的影响。

取适量的标准储备溶液，用空白基质溶液配制成质量浓度分别为2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 μg/L的混合标准工作溶液，在优化实验条件下测定，以质量浓度为横坐标(X,μg/L)，分析物峰面积与选定内标物峰面积的比值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，回归方程、相关系数见表2。7种硝基咪唑类药物在2.0～100.0 μg/L范围内线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.99。在空白饲料基质中添加混合标准品，以信噪比(S/N)≥3时的含量定为方法的检出限(LOD)，以信噪比(S/N)≥10时的含量定为方法的定量下限(LOQ)，7种药物的LOD为2.5 μg/kg，LOQ为5.0 μg/kg；饲料中添加硝基咪唑类药物的MRM色谱图见图1。

表2 硝基咪唑类药物在饲料中的基质效应、回归方程、相关系数、检出限和定量下限Table 2 Matrix effects,linear equations,correlation coefficients(r2),limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ) of nitroimidazoles in feed

2.5 回收率与精密度

在阴性饲料样品中添加硝基咪唑类混合标准品，添加水平分别为5.0，10.0，25.0 μg/kg，每个添加水平5次平行，内标法定量，得到方法回收率及精密度，结果见表3。硝基咪唑类药物的平均回收率为72.4%～95.6%，相对标准偏差(RSD)为5.8%～12.5%。

表3 饲料样品中硝基咪唑类药物的回收率与相对标准偏差(n=5)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of nitroimidazoles in feed sample(n=5)

2.6 实际样品的检测

采用本方法对本地区出口的水产饲料和畜禽饲料共43个样品进行测定，所有样品中均未检出硝基咪唑类药物，说明所检测的饲料样品中未添加硝基咪唑类药物。

3 结 论

本文建立了高效液相色谱-串联质谱测定饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物残留的分析方法。采用分散型固相萃取净化技术，并优化了样品前处理的净化方法。该方法简便快速，省去固相萃取步骤，缩短了检测周期，减少了有机溶剂消耗，且灵敏度较高，回收率好，可满足实际检测工作的需要。

[1] Palermo A M,Reynoso A S,Nigro M L，Carballo M A,Mudry M D.BirthDefectsRes.：A,2004，70(4):157-162.[2] Shen J Z,Xiang X H,Zhang Y,Zhao S.Sci.Agric.Sin.(沈建忠，项新华，张跃，赵珊.中国农业科学)，2003，36(6):700-703.

[3] Lin Y Y,Su Y,Liao X L,Yang N,Yang X P,Martin M F C.Talanta,2012，88(1):646-652.

[4] Wang J H.J.Chromatogr.A,2001，9(8):435-438.

[5] Huet A C,Mortier L,Daeseleire E,Fodey T,Elliott C,Delahaut P.Anal.Chim.Acta,2004，534(1):157-162.

[6] Hernandez-Mesa M,Garcia-Campana A M,Cruces-Blanco C.FoodChem.,2014，145:161-167.

[7] Liu B,Huang W H,Wang J Z.J.Anal.Sci.(刘波，黄为红，王金中.分析科学学报)，2008，24(5):586-588.[8] Cheng L L,Zhang S X,Shen J Z,Wang Z H,Wenren L Q.J.AnhuiAgric.Sci.(程林丽，张素霞，沈建忠，王战辉，闻人乐群.安徽农业科学)，2008，36(5):1893-1894.

[9] Hou Y L,Ding P,Guo L M.Chin.Feed(侯亚莉，丁平，郭利敏.中国饲料)，2008，8:36-38.

[10] Wang Y,Zheng C Y,He F,Ye L H.FoodSci.(王扬，郑重莺，何丰，叶磊海.食品科学)，2011，32(20):197-199.

[11] Chen Z H,Huang W J,Liu X J，Fang J H.Phys.Test.Chem.Anal.:Chem.Anal.(陈张好，黄文静，刘小娟，方继辉.理化检验:化学分册)，2014，50(2):184-186.

[12] Polzer J,Gowik P.J.Chromatogr.B,2001，761(1):47-60.

[13] Wang J C,Ma S Y,Wang D J,Han H Y,Liu D C.Chin.J.Anim.Vet.Sci.(汪纪仓，马素英，王大菊，韩鹤友，刘登才.畜牧兽医学报)，2008，39(12):1772-1778.

[14] Wang J L,Li Y K,Zhao J Y,Liu D C.Chin.J.Anal.Lab.(王金玲，李义坤，赵京杨，刘登才.分析试验室)，2010，29(1):107-110.

[15] Chen P R,Liu J N,Li X,He B.JiangsuAgric.Sci.(陈培荣，刘锦妮，李洵，何斌.江苏农业科学)，2013，41(7):292-293.

[16] He D,Li X Y,Xian Y P,Fang J,Guo X D.J.Instrum.Anal.(何东，李秀英，冼艳萍，方军，郭新东.分析测试学报)，2015，34(8):911-916.

[17] Ding T,Xu J Z,Shen C Y,Jiang Y,Chen H L,Wu B,Zhao Z Y,Li G H,Zhang J,Liu F.Chin.J.Chromatogr.(丁涛，徐锦忠，沈崇钰，蒋原，陈惠兰，吴斌，赵增运，李公海，张婧，刘飞.色谱)，2006，24(4):331-334.

[18] Liu Y M,Cao Y Z,Li J,Wu Y P,Zhang J J,Li X M,Ge N.Chin.J.Chromatogr.(刘永明，曹彦忠，李金，吴艳萍，张进杰，李学民，葛娜.色谱)，2010，28(6):596-600.

[19] Zhang H W,Jian H M,Lin L M,Chen L Z,Liang C Z,Yuan T,Tang Z X,Cai X,Qin L Y.J.Instrum.Anal.(张鸿伟，简慧敏，林黎明，陈亮珍，梁成珠，袁涛，汤志旭，蔡雪，秦良勇.分析测试学报)，2012，31(7):763-770.

[20] Guo J,Ding L P,Wu W F,Zhao J H,Chen Z T.J.Instrum.Anal.(郭菁，丁立平，吴文凡，赵建晖，陈志涛.分析测试学报),2015，34(1):28-43.

[21] Tolgesi A,Sharma V K,Fekete S,Fekete J,Simon A,Farkas S.J.Pharm.Biomed.Anal.,2012，64/65:40-48.

[22] Gadaj A,Lullo V D,Cantwell H,Mccormack M,Furey A,Danaher M.J.Chromatogr.B,2014，960:110-115.

[23] Huang Z J,Wang X L,Yang Q Z,Lin Y C.Chin.J.Anal.Lab.(黄子敬，王晓玲，杨钦沾，林玉婵.分析试验室)，2014，33(10):1184-1188.

Rapid Determination of Nitroimidazoles and Their Metabolites Residues in Feeds by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WEI Yun-ji1*,ZHU Zhen-yi1,FENG Min1,HE Jian1,SHEN Jin-rong1,HE Zheng-he1,QIN Xian1,ZHANG Ling-li1,QIAN Yi-ping1,DING Tao2

(1.State Key Laboratory of Feed Safety Testing(Huaian),Huaian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Huaian 223001,China;2.Animal,Plant and Food Inspection Center(APFIC) of Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing 210001,China)

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(HPLC-MS/MS) method was developed for the rapid determination of metronidazole(MNZ)，metronidazole-OH(MNZOH),dimetridazole(DMZ)，hydroxydimetridazole(HMMNI),ronidazole(RNZ),ipronidazole(IPZ),ipronidazole-OH(IPZOH) residues in feed.The samples were extracted with 0.1 mol/L pH 8.0 phosphate buffer and ethyl acetate-acetone(70∶30，by volume)，then cleaned up with matrix solid-phase dispersant primary secondary amine(PSA).The extracts were defatted with hexane and cleaned up by liquid-liquid partition.The target compounds were detected by electrospray ionization(ESI) in positive mode using multiple reaction monitoring,and quantified by the isotope internal standard method.No solid-phase extract(SPE) procedure was adopted，which made sample preparation simple and efficient.The calibration curves for seven target compounds were linear in the range of 2.0-100.0 μg/L with correlation coefficients more than 0.99.Average recoveries at spiked levels of 5.0-25.0 μg/kg were between 72.4% and 95.6%，with relative standard deviation less than 12.5%.The limits of detection(LOD) were 2.5 μg/kg，and the limits of quantitation(LOQ) were 5.0 μg/kg.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)；feed;nitroimidazoles;metabolites

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.014

2016-09-09；

2016-10-23

质检总局科技计划项目(2015IK131)

O657.63；TQ460.72

A

1004-4957(2017)03-0377-05

*通讯作者：魏云计，硕士研究生，工程师，研究方向：食品及饲料安全检测，Tel：0517-83336508，E-mail:jswyj_84@163.com