突变和重组可克服异源复制酶在病毒复制中的功能缺陷

卢金达，廖乾生，杜志游

(浙江理工大学 生命科学学院， 浙江 杭州 310018)

突变和重组可克服异源复制酶在病毒复制中的功能缺陷

卢金达，廖乾生，杜志游*

(浙江理工大学 生命科学学院， 浙江 杭州 310018)

异源复制酶的组合无法有效地支持重组病毒的复制是雀麦花叶病毒科病毒存在的普遍现象。利用雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属的典型成员黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus，CMV)和番茄不孕病毒(tomatoaspermyvirus，TAV)作为研究对象，分析2个复制酶的异源组合对重组病毒复制的影响。通过农杆菌浸润，将CMV RNA1(C1)和TAV RNA2(T2)进行异源组合，并将此与CMV RNA3(C3)或TAV RNA3(T3)混合侵染本生烟。接种后10 d，C1T2C3和C1T2T3接种的植物没有出现明显的病毒症状，通过Northern杂交，在系统叶中仅检测到微弱的病毒特异条带，这说明C1T2的异源组合无法高效地支持病毒的复制和侵染。当C1T2C3转接3代之后，接种的本氏烟植株表现明显的病毒症状，且病毒RNA的积累水平显著增加。病毒基因组RNA的测序结果显示，C1第1 390位、T2第1 695位发生点突变，而且C3的3′末端融合了T2的完整3′ UTR序列。以上结果表明，通过病毒的突变或/和重组可有效提高异源复制酶对重组病毒的复制效率。

黄瓜花叶病毒；番茄不孕病毒；复制酶；突变；重组

病毒基因组的突变、重组和重排是病毒自然进化的内在动力。自然界中，雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)同属病毒种间的基因组重组和重排事件发生比较普遍，但主要发生在编码移动蛋白和外壳蛋白的基因组RNA3，而非编码复制酶组分的基因组RNA1和RNA2[1-2]。雀麦花叶病毒科同属病毒种间的复制酶具有不兼容性，从而导致复制酶的异源组合不能有效地合成病毒基因组或亚基因组RNA[3]。黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)和番茄不孕病毒(tomatoaspermyvirus，TAV)同属于雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的典型成员[1]。黄瓜花叶病毒属病毒基因组由3条正义单链RNA构成：RNA1编码复制酶1a蛋白，该蛋白含有N端甲基转移酶结构域和C端解旋酶结构域；RNA2编码2a蛋白，含有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)结构域；1a、2a与寄主因子组成病毒复制复合体(replication complex，RC)，负责病毒RNA的合成与复制[2]；另外，RNA2还通过其亚基因组RNA4A编码一个RNA沉默抑制子2b蛋白[4-5]；RNA3编码移动蛋白(MP)和外壳蛋白(CP)，负责病毒的移动和包装[6]。Masuta等[7]发现CMV与TAV病毒RNA1或RNA2之间的交换不支持由RNA1、2和3组成的重组病毒的复制；但是，当TAV RNA1和TAV RNA2与CMV RNA2和RNA3混合接种本生烟，会产生一个四分体病毒，该四分体病毒由TAV RNA1、CMV RNA2、CMV RNA3以及CMV与TAV的RNA2重组体组成，该RNA2重组体是在CMV RNA2的3’末端融合了TAV RNA2的3′末端140个碱基，这说明病毒基因组含有的RNA作用元件在异源1a-2a复制酶合成病毒RNA中扮演重要角色。

为了进一步深入研究异源复制酶组合的缺陷，本研究以CMV RNA1和TAV RNA2的异源组合作为研究对象，在本生烟植物体内分析异源复制酶对重组病毒复制的作用，通过多次传代的方法，尝试利用病毒在植物体内的自身变异来克服异源复制酶的不兼容性。

1 材料与方法

1.1 试剂

Q5超保真DNA聚合酶购于NEB公司；AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂购于TaKaRa公司；农杆菌GV3101感受态细胞为本实验室自制并保存于-80 ℃冰箱；常规生化试剂购于Sigma(上海)贸易有限公司或生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 寄主植物

本氏烟(Nicotianabenthamiana)在植物生长室中培养，温度22 ℃，光周期16 h/8 h(L/D)。待植物生长至5～6叶期，用于农杆菌浸润接种。

1.3 病毒侵染性克隆的构建

根据Liao等[8]描述的CMV侵染性克隆构建的方法，将CMV Fn株系和TAV BJ株系基因组的cDNA单个地克隆至pCB301双元载体，从而构建了含CMV基因组RNA1、RNA2、RNA3的侵染性克隆pCB301-C1、pCB301-C2、pCB301-C3，以及含TAV基因组RNA1、RNA2、RNA3的侵染性克隆pCB301-T1、pCB301-T2、pCB301-T3。构建的所有质粒均经测序和病毒活性测试确定。

1.4 农杆菌浸润接种

将上述构建的侵染性克隆通过冻融法转入农杆菌GV3101。含侵染性克隆的农杆菌在含有30 mg·L-1利福平、50 mg·L-1庆大霉素和50 mg·L-1卡那霉素的LB液体培养基中28 ℃培养14～16 h，离心收集菌体，悬浮于浸润接种缓冲液(10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES和200 mmol·L-1乙酰丁香酮)，并将菌液浓度调至D600为0.5。按以下5种组合：C1C2C3、C1C2T3、C1T2C3、C1T2T3、T1T2T3，将携带相应侵染性克隆的农杆菌按等体积比进行混合，暗处放置3 h。用1 mL无菌注射器浸润接种本氏烟叶下表皮。

1.5 病毒RNA的Northern杂交检测

接种病毒14 d后，采集本氏烟顶端系统叶0.1 g，利用TRIzol试剂(Invitrogen)提取叶组织总RNA，提取方法参考试剂指导手册。病毒RNA的Northern杂交检测参考文献[9]。

1.6 病毒摩擦接种

剪取C1T2C3接种植物系统叶片，在研钵中加入5 mL接种缓冲液和少许金刚砂粉末，研磨成糊状。在供接种叶片表面均匀撒少许金刚砂粉末，用研棒蘸取混合病叶汁液，单向地从叶基向叶尖方向轻轻涂抹2～3次，接种后1～2 min，用ddH2O冲洗叶片。

1.7 RT-PCR

从转接C1T2C3 3代的感病本生烟植物上取0.1 g系统叶，并用TRIzol试剂提取其总RNA。以提取的总RNA为模板，用CMV和TAV基因组3′末端的反向引物CMV123R和TAV123R，在AMV逆转录酶的作用下合成病毒的第1链cDNA。然后以RT产物作为模板，用Q5 DNA聚合酶对C1T2C3的各个基因组进行PCR扩增。扩增的引物情况如下：CMVR1/2-F1与CMV123R扩增CMV RNA2的全基因组RNA，CMVR3-F1与CMV123R扩增CMV RNA3，CMVR3-F1与TAV123R扩增CMV RNA3的重组体，TAVR1/2-F1与TAV123R扩增TAV RNA2。引物序列如表1所示。获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和胶回收，委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。测序结果用DNASTAR软件中的Seqman程序进行序列比对和分析。

表1 PCR扩增病毒RNA所用的引物

Table 1 Sequences of primers for PCR amplifying viral genomic RNAs

2 结果与分析

2.1 CMV RNA1和TAV RNA2的异源组合对重组病毒复制的影响

通过农杆菌介导的方法，将假重组体(C1T2C3、C1T2T3和C1C2T3)及野生型(C1C2C3和T1T2T3)分别接种本氏烟，接种10 d后观察症状。结果表明，接种C1C2C3组合的本氏烟中，其顶端系统叶出现严重的病毒症状，包括植株矮化和顶端叶畸形卷曲；C1T2C3与C1T2T3接种的植物没有出现明显的病毒症状(图1-A)。通过Northern杂交检测了病毒在系统叶中的积累，结果显示，同源复制酶组合的病毒，包括C1C2C3、T1T2T3和C1C2T3在侵染植物中有相当的积累，但是，在C1T2C3侵染的植物中，仅检测到1条可能为RNA3重组体的条带；在C1T2T3接种的植物中仅检测到CMV基因组RNA3及其亚基因组RNA4的特异条带。以上结果说明CMV RNA1和TAV RNA2的异源组合不能高效地支持重组病毒在植物体内的复制侵染。

2.2 C1T2C3的转接增强了病毒的症状和病毒的积累

为了研究病毒的自发突变或重组能否克服异源复制酶的缺陷，选择接种C1T2C3植株的系统叶，通过汁液摩擦接种的方法转接健康本氏烟植株，记录植物的症状表型，并分析病毒的积累情况。转接3代之后，植物表现出顶叶卷曲畸形和植株矮小等明显的病毒症状，该症状与C1C2C3的表型相似(图2-A)。通过Northern杂交对植株系统叶中的病毒积累水平进行检测，结果如图2-B所示。C1T2C3经转接3代之后，与野生型病毒(C1C2C3)的基因组RNA积累水平相当。由此推测，C1T2C3经3代转接之后，在植物体内发生了自发突变或重组，从而导致病毒致病性增强和病毒积累增加。

2.3 C1T2C3病毒在植物体内的自发突变和重组

为了分析C1T2C3经3代转接后增强的致病性和病毒积累是否由突变或重组所致，通过RT-PCR的方法，对病毒的3条基因组RNA进行了扩增，并对PCR产物进行测序。序列比对的结果显示：CMV RNA1第1 390位碱基由G突变为A，从而导致氨基酸从甲硫氨酸(Met)突变为异亮氨酸(Ile)；TAV RNA2第1 695位碱基由U突变为A，但不影响氨基酸序列；CMV RNA3的序列并没有发生突变，但在其3′端融合了完整的TAV RNA2的3′ UTR。推测C1T2C3经3次转接之后，该重组病毒在植物体内通过自发的突变和重组，克服了CMV 1a和TAV 2a复制酶组合的不兼容性，从而增强了病毒的致病性和复制水平。

3 结论与讨论

本文通过研究CMV RNA1与TAV RNA2的异源重组，发现该异源重组不能有效地支持重组病毒C1T2C3和C1T2T3的复制，但是通过连续3次病毒传代，重组病毒通过体内的自发突变和重组很大程度上克服了异源复制酶的缺陷，这为深入研究异源复制酶不兼容性提供了良好的研究基础。

*指示条带可能是RNA3和RNA4的重组体* indicated bands probably being RNA3 and RNA4 recombinants图2 C1T2C3重组病毒转接3代后的病毒症状(A)和病毒RNA积累(B)Fig.2 Viral symptoms (A) and viral RNAs accumulation (B) of C1T2C3 after triple passages

雀麦花叶病毒科同属病毒间异源复制酶的不兼容性已有报道，例如雀麦花叶病毒(BMV)与其同属的豇豆褪绿斑驳病毒(Cowpeachloroticmosaicvirus，CCMV)[10]、CMV与其同属的花生矮化病毒(Peanutstuntvirus，PSV)间异源复制酶不兼容[11]。雀麦花叶病毒科病毒的1a蛋白C端解旋酶结构域与2a蛋白N端的140个氨基酸发生互作，是病毒复制所必需的[12-14]。Dinant等[3]发现，BMV与CCMV异源复制酶的不兼容性是由于它们不能发生互作。Suzuki等[11]发现PSV 1a与CMV 2a的互作对于异源重组病毒的复制是必需的，但不是充分的。本研究测序结果显示，CMV RNA1的突变发生在第432位，位于N端甲基转移酶结构域中，而TAV RNA2的突变则不影响2a蛋白的氨基酸序列，但是该病毒的突变或重组可以使病毒进行有效的复制积累，由此推断，CMV RNA1编码的1a蛋白和TAV RNA2编码的2a蛋白在植物体内能够发生互作。以上CMV RNA1和TAV RNA2的点突变是否与该重组病毒克服异源复制酶组合的缺陷有关，仍需后续实验的验证。Masuta等[7]发现CMV与TAV病毒RNA1或RNA2之间的交换不支持由RNA1、RNA2和RNA3组成的重组病毒的复制，但当TAV RNA1、TAV RNA2与CMV RNA2、CMVRNA3混合接种本生烟，会产生一个四分体病毒，该四分体病毒是由TAV RNA1、CMV RNA2、CMV RNA3和含有TAV RNA2 3′末端140碱基的CMV RNA2组成的重组体。说明TAV 3′ UTR与CMV病毒基因组RNA2的重组克服了异源复制酶的缺陷。本研究也发现，CMV RNA3的3′末端融合了TAV RNA2的完整3′ UTR序列，因此，推测CMV RNA3与TAV RNA2 3′ UTR的重组很可能与该重组病毒克服复制酶异源组合缺陷有关。

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(责任编辑 侯春晓)

Overcome the defect in virus replication conferred by heterogeneous combination of viral replicases through mutation and recombination

LU Jinda， LIAO Qiansheng， DU Zhiyou*

(CollegeofLifeSciences，ZhejiangSci-TechUniversity，Hangzhou310018，China)

It is a common phenomenon that recombination of heterogeneous replicases cannot efficiently replicate recombinant virus in Bramoviridae. Here， the effects of heterogeneous combination of viral replicases on viral replication was investigated usingcucumbermosaicvirus(CMV) andtomatoaspermyvirus(TAV) as the research objectives， which are the typical species of the genusCucumovirus， Bromoviridea. CMV RNA1 (C1) and TAV RNA2 (T2) were heterogeneously combined， mixed with either CMV RNA3 (C3) or TAV RNA3 (T3)， and then inoculated ontoNicotianabenthamianaplants by agroinfiltration. At 10 days post-infiltration， no obvious viral symptoms were observed on the plants inoculated with C1T2C3 or C1T2T3. Moreover， mild viral bands were detected in the upper systemic leaves of the plants by Northern blot. These results demonstrate that C1T2 heterogeneous combination could not support viral replication/infection efficiently. When C1T2C3 was passaged three times， the infected plants showed obvious viral symptoms and a high accumulation level of viral progeny RNAs. Sequencing data of viral genomic RNAs showed that C1 had a mutation at the position 1 390， and T2 had a mutation at the position 1 695. Moreover， the 3′ end of C3 was tagged with the whole 3′ UTR of T2. Taken together， the recombinant virus C1T2C3 could overcome defects in virus replication conferred by the heterogeneous combination of their replicases byinvivomutation and recombination.

Cucumbermosaicvirus;Tomatoaspermyvirus; replicase; mutation; recombination

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.14

2009-09-18

国家自然科学基金项目(31470007)

卢金达(1990—)，男，浙江温州人，硕士研究生，主要从事植物病毒分子生物学研究。E-mail: lujinda09@163.com

*通信作者，杜志游，E-mail: duzy@zstu.edu.cn

Q933

A

1004-1524(2017)03-0445-05

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 445-449

http://www.zjnyxb.cn

卢金达，廖乾生，杜志游. 突变和重组可克服异源复制酶在病毒复制中的功能缺陷[J]. 浙江农业学报， 2017， 29(3): 445-449.