DIDP和DINP暴露对小鼠的免疫毒性作用

曹昕伟,刘潇童,范宏成,黄 鑫,郭彦彦,沈世萍,丁书茂

(华中师范大学生命科学学院,湖北 武汉 430079)

DIDP和DINP暴露对小鼠的免疫毒性作用

曹昕伟,刘潇童,范宏成,黄 鑫,郭彦彦,沈世萍,丁书茂*

(华中师范大学生命科学学院,湖北 武汉 430079)

为了探究增塑剂邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)和邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)联合暴露对小鼠免疫系统毒性有无协同作用,实验采用56只SPF级雄性Balb/C小鼠,随机分为7 组,用同种浓度(200mg/kg)不同质量配比的DIDP和DINP混合药剂对小鼠进行灌胃,染毒暴露周期为28d.染毒结束后,取耳组织,测定耳肿指数和双耳重量差;取耳组织和血清,检测生物因子IgE,IFN-γ,IL-4等.实验结果显示,DIDP与DINP联合口腔暴露使小鼠皮肤炎症明显加剧(P＜0.01),且随着DINP质量比例增大,免疫毒性逐渐增强.这表明,DIDP和DINP联合暴露,对小鼠有免疫系统毒性作用.但是,联合暴露时,各指标均是呈递增或递减趋势,并未出现以某种比例混合时加强或减弱免疫毒性作用的现象.这表明,D IDP和D INP联合暴露时并未有拮抗或协同作用.

邻苯二甲酸二异癸酯；邻苯二甲酸二异壬酯；免疫毒性作用；口腔暴露；小鼠

邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)和邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)是常见的2种增塑剂.在环境污染物中,它们起到环境佐剂效应.环境佐剂是一种进入人体内可以使机体出现反应性过敏体质(IL-4和IgE水平增高)的环境污染物,能诱导发生免疫相关疾病,具有免疫毒性[1].过敏性皮炎是由过敏原引起的皮肤病属于免疫性疾病的一种,主要是指人体接触到某些过敏源而引起皮肤红肿、发痒、风团、脱皮等皮肤病症.其病因与发病机制复杂[2].口腔接触和皮肤接触是邻苯二甲酸酯类常见的暴露方式之一[3],但易被忽视.人造化学品很可能是近年来人类过敏性疾病发病率上升的主要因素[4-5].过敏性皮炎在皮肤病中占相当大的比重,但在临床工作中却往往被忽视,造成许多慢性复发性难治性湿疹[6].近年来,对于单一的增塑剂暴露对小鼠毒性方面的研究报道较多,但对多种增塑剂联合作用对小鼠过敏性皮炎的研究却鲜有出现.为了探讨增塑剂联合暴露对小鼠免疫系统毒性作用,本研究选取增塑剂DINP和DIDP为研究对象,采用联合暴露方式,探讨增塑剂联合作用对小鼠过敏性皮肤炎症影响并探明其有无协同作用,以期为控制和预防过敏性疾病的发生、保障人们健康提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性Balb/C小鼠,5～6周龄,体重(20±1.5)g,由湖北省疾病预防控制中心实验动物饲养所提供.整个实验期间,保持动物管理中心鼠房无菌状态并给予充足的饮水与饲料,垫料与饲料更换速率为1次/d,并每日进行称重记录.实验开始前,先对小鼠进行一周的适应性喂养.

1.1.2 主要仪器 5415R低温冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、FLx800荧光酶标仪(美国Bio-Tek公司)、HH-42三用电热恒温水箱(北京市长源实验仪器厂)、超声处理器、DNM-9602酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)、-70℃冰箱(日本三洋)、干燥箱(上海索普仪器有限公司)、调速调温摇床(太仓市强乐实验设备有限公司).

1.1.3 主要试剂 DIDP(美国Sigma-Aidrich公司),(DINP,美国Sigma-Aidrich公司)、FITC(美国Sigma-Aidrich公司)、丙酮(美国Sigma-Aidrich公司)、吐温80(美国Amresco公司)、4%多聚甲醛溶液(美国Sigma-Aidrich公司),IgE、IL-4和IFN-γ试剂盒(上海源叶生物科技有限公司),其他试剂均为国产分析纯级.

1.2 染毒方法

1.2.1 溶液的配制 DIDP染毒液的配制(20d染毒量):DIDP与吐温80按照1:1的比例混匀,然后用灭菌的生理盐水将其配制成200mg/kg的原液.

0.5%FITC的配制:0.5%FITC(W/V)致敏剂是以FITC为溶质,DBP(邻苯二甲酸二正丁酯, Di-n-butyl ortho-phthalate,简称DBP)和丙酮(1:1)为溶剂均匀混合而成,室温超声混匀并现配现用.单纯使用0.5% FITC不能使小鼠成为敏感模型,DBP 充当着必要的诱导作用[7].

1.2.2 确定致敏剂与效果显著浓度 根据文献[8],本项目的致敏剂选择0.5% FITC,实验浓度选取质量比例不同的总浓度为200mg/kg.

1.3 口腔暴露动物模型建立与实验分组 将56只Balb/C小鼠随机平均分为7组,每组8只.(增塑剂后数字为质量百分比)如表1所示.

表1 实验分组与染毒流程Table 1 The experimental groups and the exposure process

将小鼠以灌胃染毒的方式暴露在相同浓度(200mg/kg)但不同配比的DIDP与DINP混合溶液和0.5%FITC中进行模拟试验.每天用各组相对应剂量的DIDP与DINP混合物进行灌胃注射,共20d.第21～22d,所有组均染毒0.5%FITC以致敏,第27d所有组的右耳涂抹20μL 0.5%FITC进行激发,左耳涂对照溶剂.第28d开始检测各指标.

1.4 耳肿胀程度的检测

耳肿胀程度用耳肿指数和双耳重量差来表示,分别使用电子游标卡尺和分析天平测量.小鼠耳肿指数用28d时小鼠左右耳同一位置厚度差来表示;分别用8mm打孔器在小鼠双耳对称位置取下相同表面积(直径均为8mm)的耳部组织,分析天平称重并计算小鼠双耳质量差.

1.5 组织匀浆和各项生物学指标检测

组织匀浆的制备:收集小鼠右耳全耳,将其在预冷的PBS溶剂(phosphate buffer saline,磷酸缓冲盐溶液,起溶解保护试剂的作用,pH7.5)中漂洗,滤纸拭干,然后在冰上用玻璃匀浆器将其和预冷的PBS 进行匀浆,制成10%匀浆液,于4℃, 10000r/min离心后取上清,保存于-70℃冰箱,用于生物因子IgE,IFN-γ,IL-4相应检测.

IgE、IL-4和IFN-γ含量的测定:按照ELISA试剂盒的说明书进行操作.

1.6 统计学分析

实验数据均采用平均值±标准误表示.均采用SPSS12.0统计分析软件对实验结果进行单因素方差分析(ANOVA),随后采用LSD法进行两两对比,P＜0.05为有统计学意义.用于表示结果的柱状图均是由origin6.1统计分析软件绘图.

2 实验结果

2.1 耳肿胀程度

通过测量双耳的耳肿指数和双耳重量差来反映小鼠的耳部肿胀程度.

图1 小鼠双耳耳肿指数结果Fig.1 The result of ear swelling index

如图1、图2所示,每组小鼠的耳部均出现了不同程度的肿胀和病理学变化.与1组相比,4、5、6、7组在耳肿指数和耳重差方面均是极显著差异(P＜0.01).值得注意的是,2组与6组耳肿胀程度也均是极显著差异(两者DIDP, DINP比例呈对称形式,P＜0.01).1组与3组在耳肿指数方面是显著差异(P＜0.05),耳重差则是极显著差异(P＜0.01).1组～7组呈递增趋势,随着DINP质量比例的提高,耳肿胀程度更加严重,所以DINP炎症作用比DIDP炎症作用大.但从两图的趋势来看,并未表现出DIDP和DINP有相互拮抗或协同的作用.

图2 小鼠双耳耳重差结果Fig.2 The result of difference of bilateral ear weight

2.2 IgE水平的检测

图3展示了各组小鼠血清当中的IgE含量变化.可以看出,随着DINP质量比例的增加,IgE含量逐渐增加.与第1组相比,2、3、4、5、6、7组都有明显增大,均是极显著差异(P＜0.01),且具有统计学意义.第2组～第6组均为混合组,可以发现它们均比第1组高,而比第7组低.

2.3 IL-4水平的检测

图4展示了各组小鼠右耳耳组织匀浆中IL-4含量变化.可以看出,随着DINP的质量比例增加,IL-4含量逐渐增加.与第1组相比,5、6、7组均有较明显增大,均是极显著差异(P＜0.01),3、4组增大不明显,4组为显著性差异(P＜0.05),具有统计学意义.第2组和第6组为比例反向对应组,2、6组对比为极显著差异(P＜0.01).第2组～第6组均为混合组,它们均比第1组高,比第7组低.

图3 小鼠血清中IgE含量结果Fig.3 The result of IgE content in mice serum

图4 小鼠右耳IL-4含量结果Fig.4 The result of IL-4content in mice right ears

2.4 IFN-γ水平的检测

图5展示了各组小鼠右耳耳组织匀浆中IFN-γ含量变化.可以看出,随着DINP质量比例增加,IFN-ɣ含量逐渐降低.与第1组相比,2、3、4、5、6、7组均有较明显下降,而2、3组为显著差异(P＜0.05),4、5、6、7组则为极显著性差异(P＜0.01),均有统计学意义.第2组～第6组的混合组,均比第7组高,比第1组低.

图5 小鼠右耳IFN-γ含量结果Fig.5 The result of IFN-γ content in mice right ears

3 讨论

3.1 DIDP和DINP对小鼠皮肤炎症作用

耳肿胀程度是本实验中最直接的观测指标,也是评价该暴露模型严重程度的重要指标之一[9].可以看出随着DINP质量百分比的增加,小鼠对于过敏原的刺激更加敏感,表现为耳朵平均厚度增加,重量加重,耳肿胀程度严重,而在DINP的剂量达到100%时,耳肿胀程度最严重.已有研究表明增塑剂DIDP和DINP两者均有过敏性皮炎的佐剂作用[8-10],而本实验这些变化直观的表明了DINP相较于DIDP免疫佐剂效应更加明显,从柱形图趋势也可看出两者无相互作用的关系.

3.2 DIDP和DINP对小鼠免疫系统作用

从血清中的IgE实验数据可以看出,随着DINP质量比例的升高,DIDP质量比例的下降,IgE逐渐增大.说明作为过敏反应的介质,有明显的佐剂效应,会导致更多的Th2型反应的产生.

而从耳组织匀浆中IFN-γ、IL-4的实验数据可以看出,随着DINP质量比例的升高,DIDP质量比例的下降,IL-4含量逐渐增大,IFN-γ含量逐渐减少.由于IL-4促进IgE的合成,而IFN-γ抑制IL-4所诱导的IgE合成,所以更加促进了IgE合成,有更多Th2型反应,从而更加促进了IgE介导的过敏,有明显的佐剂效应.

综合3种生物因子的数据,2、3、4、5、6组中IgE和IL-4含量均大于1组且小于7组,呈递增趋势.2～6组中IFN-γ含量均小于1组且大于7组,呈递减趋势.这些有规律的趋势表明,以某种比例混合时,并未出现协同或拮抗作用.但由于本实验质量比例设置仍有一定跨度,不排除以本实验质量比例之外的比例出现相互作用的可能性.

另外,3种生物因子数据图表明,在混合口腔暴露时,DINP和DIDP不受互相影响,且DINP的过敏佐剂效应强于DIDP.

4 结论

4.1 不同质量百分比的DIDP和DINP配比剂量混合暴露时对小鼠过敏性皮肤炎症有明显的佐剂效应,比单一DIDP作用时更能增强小鼠过敏炎症反应.同时,DINP的免疫毒性高于DIDP,在两者混合暴露时,DINP更能增强小鼠的皮肤炎症.

4.2 DIDP和DINP以不同质量比例混合暴露时,并未出现拮抗或协同作用.

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致谢：感谢环境生物医学实验室的精心指导和大力支持,感谢团队中每一个成员付出的努力,也感谢丁书茂老师的指导.最后,也感谢我们求助过的每一位师兄师姐,以及向小白鼠们致敬.

Effect of combined exposure of DIDP and DINP on the immune toxicity in mice.

CAO Xin-wei, LIU Xiao-tong, FAN Hong-cheng, HUANG Xin, GUO Yan-yan, SHEN Shi-ping, DING Shu-mao*
(School of Life Sciences, Central China Normal University, Wuhan 430079, China). China Environmental Science, 2017,37(2)：740～744

In order to study the adjacent benzene two formic acid di isononyl ester (DINP) and adjacent benzene dicarboxylic acid diisodecyl ester (DIDP) combined exposure toxicity effect on immune systemin mice with and without cooperativity. The 56SPF BALB/c mice, were randomly divided into 7groups, with the different mass ratio of DIDP and DINP mix of chemicals at the same concentration (200mg/kg) on mice were intragastric exposure, the period was 28days. After the end of exposure, the ear tissues were taken to measure the ear swelling index and ear weight differences. The tissues and serumwere taken to detect the biological factors IFN-γ, IgE, IL-4and so on. The experimental results showed that the combined exposure of DIDP and DINP made the skin inflammation of mice significantly increased (P＜0.01), and with the increase of the proportion of DINP, the immune toxicity gradually increased. This suggested that DIDP and DINP were associated with an immune systemthat was toxic to mice. However, when the combined exposure, each index was presented increasing or decreasing trend regularly, did not appear in a certain proportion of the phenomenon of strengthening or weakening of the immune toxicity. This suggested that DIDP and DINP did not have antagonistic or synergistic effects when combined with exposure.

di-isodecyl ester (DIDP)；di-isonony l phthalate (DINP)；immune toxicity；mouth exposure；the mice

X503.22,R7582

A

1000-6923(2017)02-0740-05

曹昕伟(1994-),男,四川广元人,华中师范大学生命科学学院在读本科生,研究方向为环境微生物学.

2016-05-26

华中师范大学教育部资助大学生创新实验项目(2015020175)

* 责任作者, 副教授, dingsm@mail.ccnu.edu.cn