非典型溶血尿毒综合征患儿14例临床表型与基因型分析

王春燕 沈 茜 孙 利 李国民 吴冰冰 徐 虹

·论著·

非典型溶血尿毒综合征患儿14例临床表型与基因型分析

王春燕1沈 茜1孙 利2李国民2吴冰冰3徐 虹1

目的 对非典型溶血尿毒综合征(aHUS)临床表型和基因型分析了解与预后的关系。方法 纳入临床表现符合血栓性微血管病(TMA)的患儿，通过ELISA法行ADAMTS13酶活性的检测，对ADAMTS13酶活性>10%，且排除其他类型HUS，行肾脏267个基因panel(包括aHUS已知的与发病相关的C3、C4、C5、CFH、CFB、CFI、MCP、CFHR1、CFHR3、CFHR5、THBD、PLG、DGKE)二代测序，对测序结果阳性的基因行sanger验证。提取纳入的aHUS患儿的随访资料，比较基因突变与未突变患儿预后，系统检索文献，行aHUS临床表型与基因文献复习。结果 14例aHUS患儿进入本文分析，男6例，女8例，5例累及肾脏以外系统。基因检测阳性和阴性者SCr分别为335.3和247.8，eGFR分别为28.8和21.2，C3降低分别为3例和4例，随访时间1～67个月，末次随访结局：基因检测阳性和阴性死亡分别为2例和0例，复发分别为2例和0例，终末期肾病(ESRD)分别为3例和0例，eGFR分别为48和103.7。检索Pubmed数据库，对包括本文病例在内的成人(148例)和儿童(154例)aHUS病例行临床特征和基因型分析，男性病例儿童多于成人，差异有统计学意义；前驱感染(消化和呼吸道)儿童较成人比例高，差异有统计学意义；除神经系统受累、肺泡内出血及高血压外，儿童较成人更易累及其他系统(肝炎、胰腺炎等多器官受损)；成人Scr异常高值大于儿童，差异有统计学意义。CFH突变率欧洲人群高于亚洲，差异有统计学意义。结论 儿童和成人CFH突变均较未突变的aHUS病例预后差，儿童较成人aHUS病例更易累及肾脏、神经以外的系统。

非典型溶血尿毒综合征； 儿童； 临床表型； 基因

非典型溶血尿毒综合征(aHUS)是一类罕见疾病，临床主要表现为微血管溶血性贫血、血小板减少、急性肾脏功能受损，是导致儿童急性肾衰竭的常见原因，预后差，文献报道约25%的aHUS患者急性期死亡，50%的aHUS患者进展为终末期肾病(ESRD)[1]。遗传因素在aHUS的发病中起重要作用。本文前瞻性地收集复旦大学附属儿科医院(我院)确诊的aHUS病历，采集临床表型、分子遗传学信息和随访结局，并检索国内外aHUS文献行文献复习。

1 方法

1.1 病例纳入标准 我院2013年以来初步建立了aHUS诊断和病因学研究的流程：①aHUS诊断符合以下标准，发病年龄<18岁；存在微血管性溶血性贫血、血小板减少和器官损害(主要为肾脏损害)； ADAMTS13酶活性>10%。②符合aHUS诊断病例行二代测序明确发病原因。③排除典型的HUS和肺炎链球菌相关性HUS等。至2016年12月前在我院完成aHUS诊断和病因学研究流程的连续病例。

1.2 病例信息采集 采集人口学资料(性别、发病年龄等)，临床表现，实验室检查(肾功能、LDH、补体C3、ADAMTS13酶活性)，连续随访情况和aHUS二代测序结果。

1.3 ADAMTS13酶活性检测 血浆治疗前抽取外周血2mL,枸橼酸钠抗凝，3 000 rpm离心，抽取上层血浆，行ELISA法(Technoclone ADAMTS-13 activity ELISA kit)检测。

1.4 随访中相关预后定义 ①急性肾衰竭：48 h内血肌酐(SCr) ≥26 μmol·L-1(0.3 mg·dL-1)或≥基线的1.5倍; ②ESRD:eGFR <15 mL·min-1·1.73 m-2或需要进行透析的患儿；③贫血：Hb<120 g·L-1(年龄4～6个月<100 g·L-1)；④PLT减少：PLT<150×109·L-1; ⑤少尿：24 h尿量<400 mL;⑥高血压:3次血压测定平均收缩压和或舒张压≥同年龄、同性别及同身高的血压的P95。

1.5 aHUS 二代测序

1.5.1 测序方法 取得患儿监护人知情同意，抽取患儿外周静脉血2 mL,EDTA抗凝，应用QIAGEN试剂盒(Qiagen Inc.,Valencia,Calif.,USA)提取基因组DNA并测定其浓度。行肾脏267个基因panel的二代测序，panel中包括目前已经报道的与aHUS发病相关基因C3 、MCP、CFB、CFH、CFHR1、CFHR2 、CFHR3、CFHR4 、CFHR5、CFI、C5、THBD、DGKE和PLG，对测序结果为阳性的患儿进行Sanger法验证。

1.5.2 测序结果分析 对测序结果阳性的aHUS患儿,查询HGMD(human gene mutation database)了解相关突变的致病性，在千人基因库( http://www.1000genomes.org/data)及Exac Broswer(http://exac.broadinstitute.org/)中查询突变的等位基因频率，通过 SIFT(http://sift.jcvi.org)及PolyPhen2.0 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/dbsearch.shtmL)、 provean(http://provean.jcvi.org/index.php)和Mutation Taster(http://www.mutationtaster.org/)进行其致病性预测，判断突变位点致病情况。

1.6 文献检索和排除原则 以(mutation AND aHUS OR mutation AND "Atypical Hemolytic Uremic Syndrome")为检索式检索PubMed数据库，以“突变”AND“aHUS”OR“非典型溶血尿毒综合征”为检索式，检索万方和中国知网等数据库。排除二次文献、评论、讲座和单个病例报告。

2 结果

2.1 aHUS患儿临床和遗传特点 14例aHUS患儿进入本文分析，男6例，女8例，发病年龄(3.6±2.7)岁。表1显示，发病前4例有上呼吸道感染病史，2例有腹泻病史,均无明确的家族史，少尿6例，高血压7例，CNS受累4例，心脏和肺受累1例，B超均提示双肾肿胀损害，结构不清。基因检测阳性9例。

表1显示，依照基因检测阳性和阴性的结果，①实验室检查：SCr(μmol·L-1)分别为335.3和247.8，eGFR(mL·min-1·1.73 m-2)分别为28.8和21.2，Hb(g·L-1)分别为76.6和83.5，PLT(109·L-1)分别为54.3和98.0。C3降低分别为3例和4例，蛋白尿+分别为3例和2例，高血压分别为6例和1例；②均进行定期随访，随访时间1～67个月，末次随访结局：基因检测阳性和阴性病死分别为2例和0例，复发分别为2例和0例，CKD-I分别为1例，ESRD分别为3例(1例目前为肾移植后2月，2例目前腹膜透析中)和0例，蛋白尿分别为1例和2例，eGFR(mL·min-1·1.73 m-2)分别为48和103.7。

表2显示，9例基因检测阳性，CFH、CFI杂合突变分别为3例和1例，MCP、CFHR1纯合突变各1例，CFHR1基因3-5号外显子杂合缺失1例，同时有CFB和C3基因的杂合突变1例，CFH基因20号外显子重复及CFHR1基因4号外显子缺失1例。3个位点(C3 ，c.21G>A；CFH，IVS8+4A>G；CFI，c.772+1G>T)为新发突变。

2.2 文献复习 Pubmed数据库检索到5篇[4～8]符合本文aHUS纳入标准的文献，分别来自于美国[4]、意大利[5]、韩国[6]、中国[7]、法国[8]，其中美国文献[4](144例)不能拆分成人和儿童病例，未详细提供临床数据，提供了基因检测结果；法国文献[8]成人125例，儿童89例，分别提供了临床数据和基因检测结果；意大利文献[5]成人104例，儿童169例，未分别提供临床数据和基因检测结果；韩国文献[6]为51例儿童aHUS病例，中国文献[7]为23例成人aHUS病例，均提供临床数据和基因检测结果。表3汇总了包括本文报告的14例在内的儿童和成人aHUS病例临床特征和实验室检查结果，男性病例儿童多于成人、前驱感染(消化和呼吸道)儿童较成人比例高，差异均有统计学意义；除神经系统受累、肺泡内出血及高血压外，儿童较成人更易累及其他系统(肝炎、胰腺炎、多器官受损)；成人Scr异常高值大于儿童，差异有统计学意义。

表1 14例非典型溶血尿毒综合征患儿临床特征及随访结果

注 Hb：g·L-1；PLT×109·L-1; Scr:mmol·L-1; eGFR:mL·min-1·1.73 m-2，CKD-Ⅰ：慢性肾脏病Ⅰ期，上感：上呼吸道感染

表2 9例非典型溶血尿毒综合征患儿基因检测结果

注CFH：补体因子H：CFB：补体因子B；MCP：膜结合蛋白；MAF：最小等位基因频率； NA：未见报道

本文将美国[4]、法国[8]、意大利[5]文献中的研究人群作为欧洲人群，将韩国[6]、中国[7]文献中的研究人群作为亚洲人群，行不同基因的突变频率进行比较。表4显示，欧洲人群CFH突变率高于亚洲，差异有统计学意义，余其他基因突变频率差异均无统计学意义。

汇总成人随访结局数据完整的法国[8]和意大利[5]文献，图1显示，不同基因突变较未突变患者死亡和ESRD风险增加了1.2倍；CFH和CFI基因突变较未突变患者死亡和ESRD风险分别增加了1.6倍和1.4倍；MCP基因突变较未突变者死亡和ESRD风险降低了55%。图2显示，不同基因突变较未突变患者复发风险增加了1.8倍；CFH、MCP和CFI基因突变较未突变患者复发风险分别增加了1.7倍、2.7倍和2.1倍。汇总儿童随访结局数据完整的法国[8]和韩国[6]文献，图3显示，不同基因突变较未突变患者死亡和ESRD风险差异无统计学意义；CFH基因突变较未突变患儿死亡和ESRD风险分别增加了1.8倍；MCP基因突变较未突变患者死亡和ESRD风险降低了68%。

表3 已报道的非典型溶血尿毒综合征患儿的临床特征和实验室检查

表4 欧洲与亚洲的aHUS患者不同基因突变比例比较[n(%)]

图1 不同基因突变与无基因突变患者进展为ESRD和死亡比较

图2 不同基因突变与无基因突变患者复发的比较

图3 不同基因突变与无基因突变患儿死亡和ESRD的比较

3 讨论

aHUS为TMA中的一种疾病，发病率为0.4/100 000～6/100 000，临床主要表现为微血管溶血性贫血、血小板减少及肾功能受损[9]，起病急，预后差，临床表现与血栓性血小板减少性紫癜(TTP)不易鉴别，既往通过临床是否有神经系统受累与TTP进行鉴别，本研究14例患儿中4例累及神经系统，但ADAMTS13酶活性正常，因此，ADAMTS13酶活性检测对临床诊断及鉴别诊断极其重要，14例aHUS患儿中9例(64.3%)遗传学检测阳性，说明遗传因素在其发病中起重要作用，9例遗传学检测阳性患儿中CFH突变比例高(33.3%)，且预后差，2例死亡，1例为ESRD，与本文文献复习结果一致， 14例aHUS患儿随访结果显示，基因突变较未基因突变的肾功能差，进一步说明对aHUS患儿行遗传学检测对判断其长期预后极其重要。

本研究通过对aHUS的临床与分子遗传学的研究，总结TMA的诊断与鉴别诊断流程(图4)，对临床诊断为TMA的患者，均应行ADAMTS13酶活性检测，对 ADAMTS13酶活性<10%诊断为TTP[10]，并行抗-ADAMTS13抗体和基因检测，进一步行TTP分型，相关分析见文献[11]，不再赘述。ADAMTS13酶活性≥10%的患儿，诊断为HUS，结合临床病史及实验室检查进一步进行分型[12～14]，有器官移植、恶性肿瘤等病史可诊断为继发性HUS，肺炎链球菌检测阳性可诊断为肺炎链球菌相关性HUS，血尿串联质谱检测结果示甲基丙二酸升高者，需考虑是否为VB12缺乏引起的HUS，并进一步行与其发病相关的MMACHC基因检测加以确诊，粪大肠埃希菌O157∶H7培养阳性，结合其发病前期明显腹泻病史，可诊断HUS，排除以上致病因素，则可诊断为aHUS，行全基因组测序或aHUS已知致病基因测序，进一步明确aHUS病因[15,16]。

图4 血栓性微血管病临床与实验室诊断流程

通过复习文献，比较成人与儿童aHUS患者临床数据及实验室检查结果，提示成人aHUS患者中女性较多，可能与妊娠是成人aHUS较常见的诱因相关，儿童较成人易出现肝脏、胰腺及多器官累及[4～8]，提示儿童急性期临床表现较成人重，需积极干预，减少急性期病死率。比较欧洲与亚洲aHUS患者不同基因突变频率，提示欧洲aHUS患者中CFH突变频率高于亚洲，可能与欧洲与亚洲aHUS人群遗传背景不同相关，余基因突变频率差异无统计学意义，可能与样本库较小且其所占的比例较少相关。

总体而言，基因突变较未突变的aHUS患者死亡和ESRD风险增加； 成人和儿童aHUS中，CFH基因突变较未突变者死亡、ESRD和复发风险均升高，MCP基因突变较未突变者死亡和ESRD风险降低。

随着对aHUS发病机制的深入研究，其治疗也取得了突破性进展。Eculizumab为C5的单抗，可以特异性阻断补体通路的激活，研究发现Eculizimab可以明显长期改善aHUS患儿肾功能， 2011年由FDA批准为aHUS患儿治疗药物， Eculizimab目前主要用于补体替代途径相关基因突变引起的aHUS[17，18]，但我国目前无此药上市。

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(本文编辑：张崇凡，孙晋枫)

Analysis of genotype-phenotype correlation in 14 patients with atypical hemolytic uremic syndrome

WANGChun-yan1,SHENQian1,SUNLi2,LIGuo-min2,WUBing-bing3,XUHong1

(1DepartmentofNephrology,ShanghaiKidneyDevelopment&PediatricKidneyDiseaseResearchCenter,2DepartmentofRheumatology,3MedicalTranslationalCenter，Children'sHospitalofFudanUniversity，Shanghai201102,China)

XU Hong,E-mail:hxu@shmu.edu.cn

Objective To investigate the relationship between the genotype and long-term progress in atypical hemolytic uremic syndrome.MethodsPatients diagnosed with thrombotic microangiopathy were included and examined for ADAMTS13 activity.The patients whose ADAMTS13 activity was above 10% were screened for mutations in 267 kidney disease related genes using next generation sequencing.The mutations were confirmed using the Sanger sequencing.The patients were grouped according to their genetic characteristics and compared for the long-term progress.The literatures of aHUS genotype-phenotype were reviewed.ResultsFourteen patients were included in our study,Other organs were involved in 5 patients.9 of 14 patients (64.3%) were reported with at least one mutation.Heterozygous mutations were found in 3 cases and one case inCFHandCFIgenes respectively.One patien was identified with homozygous mutation onMCP,one patient with homozygous mutation onCFHR1 ,one with exon 3-5 deletion of theCFHR1,one with combined mutation ofC3 andCFB,one with combinedCFHexon 20 duplication and exon 4 deletion ofCFHR1.Three novel mutations were identified,C3 (c.21G>A),CFH(IVS8+4A>G) andCFI(c.772+1G>T).Comparing the clinical features of mutation carriers and non-carriers,the mutation carrier's kidneys involved the eGFR (mL·min-1·1.73 m-2)were 28.8 and 21.2,respectively,lowC3 was found in 4 patients and 3 patients,respectively.During the follow-up for 1-67 months,clinical outcomes varied in mutation-carrier patients,one died during the acute stage and 3 patients progressed to end stage renal disease.Of 3 ESRD patients,one had received renal transplant,2 experienced recurrence and one died.There were no patient died or progressed to end stage renal disease in mutation non-carrier patients.In literatures,children patients were reported to has a high proportion in trigger events and other organs involvement,ConclusionCFHmutations lead to poor long-term progression in aHUS patients and Other organs are more easily involved in children.

Atypical hemolytic uremic syndrome; Children; Phenotype; Gene

1 复旦大学附属儿科医院 1肾脏科，上海市肾脏发育和儿童肾脏病研究中心，2 风湿科，3 转化医学中心 上海，201102

徐虹 ，E-mail:hxu@shmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5501.2017.01.011

2017-01-03

2017-02-23)