九头狮子草抗菌有效组分分析

张丽娟ZHANG Li-juan 王 正 廖尚高 -

(1. 贵州理工学院食品药品制造工程学院，贵州 贵阳 550001；2. 湖北医药学院药学院，湖北 十堰 442000；3. 贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004)

九头狮子草[Peristrophejaponica(Thunb.)Brem.]为爵床科(Acanthaceae)九头狮子草属(PeristtropheNees)植物，别名辣叶青药、尖经药、咳风尖、晕病药等，其性味辛、凉，具有清肺泻火、消肿解毒的功能，在贵州省布依族民间广泛应用于小儿高热、小儿惊风等病症的治疗[1]。以咽喉清喉片(贵州奥特药业)和甘果含片(浙江永宁制药厂)等为代表的具有抗菌、抗病毒、解热、抗炎作用的中药制剂，已在市场上获得了广泛认可。现代研究发现，九头狮子草以烷烃和甾醇类化合物为其主要成分，也含少量黄酮、木脂素类等化合物[2-4]，具有很好的解热镇痛[5-6]、镇咳祛痰、杀菌止痒、抗炎、保肝、抗肝炎病毒[7]等作用。罗忠圣[8]、覃容贵等[9-10]证实，九头狮子草的各种粗提物对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌均有较强的抑制作用。但迄今为止，九头狮子草抗菌活性的有效部位及其相关物质基础未见报道。本研究拟采用大孔树脂柱层析将九头狮子草95%乙醇提取物分成了化学组成不同、极性差异较大的3个部位，分别对各部位进行抗菌活性评价，从中筛选出抗菌活性组分，再应用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对该活性组分进行化学分析，以期为九头狮子草的抗菌药效物质基础研究及深度开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

九头狮子草:由贵阳医学院药用植物学及生药学教研室鉴龙庆德副教授鉴定，为Peristropejaponica(Thunb) Brem的干燥全草；

标准菌株：大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)、奇异变形杆菌(ATCC 35659)：美国模式培养物集存库(ATCC)；

MH琼脂培养基、MH肉汤培养基：杭州微生物试剂有限公司；

D101大孔树脂：天津浩聚树脂科技有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

桌上式洁净工作台：HJ-VD-650型，上海苏净实业有限公司；

电热恒温培养箱：HPX-9052MBE型，上海博迅实业有限公司；

手提式压力蒸汽灭菌器：YXQ-SG46-280S型，上海博迅实业有限公司；

GC-MS联用仪：Agilent Technologies 7890A型，美国安捷伦科技公司。

1.2 方法

1.2.1 组分制备 称取干燥九头狮子草全草250 g，用10倍质量的95%乙醇回流提取2次，每次2 h。合并滤液后浓缩得浸膏18.0 g，D101大孔树脂湿法上样，依次用水、80%乙醇、丙酮溶液洗脱，洗脱液分别浓缩至浸膏，得到大极性的组分A、中极性的组分B以及小极性的组分C。临用前取各组分低温冷冻干燥成粉末，再用二甲基亚砜配制成所需浓度。

1.2.2 有效组分筛选

(1) 菌悬液的制备：将供试菌株分别接种于MH琼脂平板，37 ℃培养24 h后，挑取平板上形态相同的菌落，用灭菌生理盐水校正菌液浓度至2.40×10-5mol/L。校正后的菌液均在15 min内接种[11-12]。

(2) 纸片扩散法抑菌试验：用无菌棉签蘸取菌悬液，在琼脂表面均匀涂布。平板室温干燥3～5 min后，用无菌镊子将直径6 mm的无菌干燥滤纸片贴在已接种测试菌的琼脂表面，每块平板贴4片，并用移液枪吸取各组分溶液1 μL，均匀添加在纸片上，每组分每供试菌平行重复3次试验。将平板置37 ℃孵育18～20 h后观察结果，测定抑菌圈直径大小。用二甲基亚砜做阴性对照，庆大霉素(1 280 μg/mL)做阳性对照[11-12]。

(3) MIC及MBC的测定：采用试管2倍稀释法测定MIC。取15支灭菌试管为一组。其中每组第13、14、15管分别标上肉汤对照、检测菌对照、溶剂对照。每支试管分别加入MH 肉汤2 mL。取抗菌活性最好的组分用MH肉汤稀释成60 mg/mL的药液。吸取2 mL 60 mg/mL的药液加入到第1 管，混匀后吸取2 mL 加入到第2 管，以此类推，直至第12管。第1～12管的药物浓度分别为60.00，30.00，15.00，7.50，3.75，1.88，0.94，0.47，0.24，0.12，0.06，0.03 mg/mL。除肉汤对照管外，其余各管均加入菌液0.1 mL，37 ℃培养24 h 后，观察生长情况。在对照管符合要求的情况下，以无菌生长的最低稀释度为MIC。在MIC测定的基础上，将未见细菌生长的各管培养物涡旋混匀后，分别吸取0.1 mL接种于2块MH固体培养基上，37 ℃培养18 h。用活菌计数法测定平板上的菌落，平均数小于5个的最小稀释度的药物浓度即为MBC。该试验重复3次，并以1 280 μg/mL为初始浓度的庆大霉素做阳性对照[11-12]。

(4) 有效组分中化学成分的GC-MS分析：将样品用色谱甲醇溶解配制成1 mg/mL的待检品。色谱条件：色谱柱为DB-17(30 m×250m×0.25m)弹性石英毛细管柱；进样口温度230 ℃；程序升温：起始温度70 ℃，以20 ℃/min速率升温至230 ℃；分流比1∶1；进样量1L；载气流量2 mL/min；溶剂延迟3.50 min。离子源:电子轰击源；以氦气为载气；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；电子轰击能量70 eV；电子倍增器电压1 435 V；接口温度230 ℃；扫描质量范围m/z30～800。运用Agilent GC-MS化学工作站对所获得数据进行数据处理，通过标准质谱库检索鉴定成分，按面积归一化法进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 九头狮子草各组分的抑菌活性

九头狮子草的各组分药液(60 mg/mL)对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及奇异变形杆菌均有不同程度的抑菌作用(见表1)，其中组分C对4种菌株抑制较为明显，为九头狮子草的主要抗菌有效组分。

† “-”表示溶剂空白无抑菌圈。

2.2 有效组分的MIC及MBC测定

九头狮子草组分C对各试验菌株的MIC及MBC测定结果见表2。结果表明，组分C对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌抑菌作用较强，对铜绿假单胞菌抑菌活性稍弱。并且组分C的MIC均小于MBC。

2.3 GC-MS分析

通过优化条件，有效组分的主要色谱峰得到了较好的分离(见图1)。定性、定量分析结果(见表3)表明，有效组分C中主要含有十八烷酸等26种化合物，这26种化合物的含量占有效组分可测成分含量的80.95%。其中棕榈酸含量最高(26.14%)，其次是亚油酸(12.08%)、硬脂酸(8.84%)和油酸(6.48%)等。

Figure 1 Total ion current chromatogram of the effective fractions fromPeristrophejaponica(Thunb.) Brem by GC-MS

† 含量低于0.15%的成分未在表中列出。

3 结论

九头狮子草各组分均有不同程度的抗菌作用，其中大孔树脂柱层析丙酮洗脱部位抗菌活性最强(组分C)，对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及奇异变形杆菌均有一定的抗菌作用。GC-MS分析表明，组分C中主要含有脂肪酸及其衍生物，与文献[13]报道的此类化合物具有较好的抗菌活性相一致。张希等[14]研究发现棕榈油酸、油酸、亚油酸等能有效抑制致病性大肠埃希氏菌O157:H7以及白色念珠菌的生长繁殖；Sun等[15]通过比较脂肪酸及其单脂肪酸甘油酯对幽门螺旋杆菌的抑菌效果也发现，油酸和亚麻酸是抗菌作用最为有效的不饱和脂肪酸；Walters等[16]发现亚油酸能有效抑制终极腐霉菌、立枯丝核菌、燕麦叶炫菌、可可丛枝病菌(植物病害菌)的生长；叶湘漓等[17]研究发现椪柑籽的主要成分为油酸、亚油酸、棕榈酸等，椪柑籽油具有调节动物血脂的作用。这些脂肪酸及其衍生物主要是作用于微生物细胞膜，引起电子传递链中断、氧化磷酸化解偶联、细胞内容物溶出，同时抑制胞内酶活性，减弱细胞对营养物质的吸收利用，并通过自身过氧化、自动氧化反应产生的 H2O2以及活性氧杀死细菌[18]。以上研究说明，以棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等为主要成分的脂肪酸类化合物可能是组分C的主要抗菌药效物质，也可能是九头狮子草的主要抗菌活性成分。由于GC-MS仅能对组分中可挥发的成分进行分析，组分C的其它成分是否也与其抗菌作用相关，尚需进行进一步的研究。在后期研究中，可以将九头狮子草挥发性成分提取纯化后开发成新型食品防腐剂[19]。

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