肺炎支原体肺炎外周血miRNAs差异表达谱的筛选与验证

丁 莹 雷小丽 孙 旦 李玉琴 储 矗 陈正荣 季 伟 周卫芳

苏州大学附属儿童医院（江苏苏州 215000）

肺炎支原体肺炎外周血miRNAs差异表达谱的筛选与验证

丁 莹 雷小丽 孙 旦 李玉琴 储 矗 陈正荣 季 伟 周卫芳

苏州大学附属儿童医院（江苏苏州 215000）

目的筛选肺炎支原体肺炎（MPP）患儿差异表达的血浆miRNAs，并予以验证。方法入选36例MPP患儿，27例健康对照儿童；对3例MPP患儿及3例对照儿童的血浆样本进行miRNA芯片筛选，获得miRNA表达谱；RT-qPCR法检测全体研究对象外周血白细胞中miR-222-3p及miR-492的表达量并进行比较。结果MPP患儿血浆中筛选出26条与对照组有显著差异的miRNAs，其中19条miRNAs表达上调，7条miRNAs表达下调；与对照组比较，MPP组miR-222-3p及miR-492的表达上调，差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论MPP患儿部分miRNAs表达有变化，可能参与MPP的免疫发病机制。

肺炎支原体肺炎； miRNA芯片； 儿童

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）是儿童呼吸道感染的常见病原体，近年来文献报道，重症MP感染逐渐增多，除肺炎、胸腔积液、闭塞性毛细支气管炎等肺内表现外，少数可引起严重的肺外并发症，如心肌炎、免疫性溶血性贫血、肝肾功能损害等[1-3]。MP感染的免疫发病机制是儿科界的研究热点。MicroRNAs（miRNA）是一类长约21～25个核苷酸、具有调控功能的非编码RNA，miRNA参与各种生物学功能调控，在肺炎支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）患儿中的表达国内外尚无文献报道。本研究筛选检测MPP患儿外周血中的miRNA表达谱，检测外周血miR-222-3p及miR-492的表达量验证芯片结果。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2014年3月至2015年6月在苏州大学附属儿童医院住院确诊为MPP的患儿36例。研究对象入选标准：①年龄＜14岁；②均有肺炎临床特征，符合《诸福棠实用儿科学》第7版诊断标准；③MP-DNA-PCR和MP-IgM均为阳性；④通过鼻咽分泌物直接免疫荧光、PCR、血培养、流式细胞仪检测排除常见的病毒、衣原体、结核菌等呼吸道感染性疾病，以及支气管肺发育畸形、免疫缺陷病等。

以同期健康体检儿童27例作为正常对照组（NC组）。NC组入选标准：①年龄、性别与MPP组匹配；②无慢性器质性疾病；③3个月内无急性感染性疾病史。

本研究经苏州大学附属儿童医院伦理委员会批准同意，患儿家长签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 MPP患儿入院后次日清晨、对照组体检时空腹采集静脉血2 mL，抗凝。于2 h内4℃，2 500 r/min（离心半径10 cm）离心10 min，吸取上层黄色血浆－80℃冻存。剩余血细胞按红细胞裂解法分离获得白细胞，加入1 mL TRIzol吹打混匀得到白细胞TRIzol混合液，－80℃冻存备用。

1.2.2 miRNA基因芯片筛选 选取3例MPP患儿和3例对照组儿童的血浆标本送康成生物工程有限公司进行高通量miRNA基因芯片检测及筛选。冰上溶解血浆标本，按照TRIzol试剂及miRNeasy mini试剂盒说明书提取并纯化血浆RNA。采用miRCURYTMArray Labelling 试剂盒进行miRNA 标记，miRCURYTMLNA Array芯片进行miRNA杂交。杂交后用洗涤缓冲液试剂盒洗涤芯片数遍，1 000 r/min离心5 min（离心半径10 cm）。芯片干燥后立即使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪进行图像扫描采集原始荧光强度数据，采用GenePix pro V6.0进行原始数据分析，筛选差异表达的miRNA并进行聚类分析。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测miR-222-3p及miR-492表达 36例MPP患儿及27例对照组儿童的白细胞TRIzol混合液冰上溶解，提取并纯化RNA，分光光度计测定RNA的质量和浓度。miR-222-3p及miR-492以U6为内参，按照miRNA/mRNA 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）试剂盒说明书测定样本中miR-222-3p及miR-492的表达，采用相对表达量2-ΔΔCt法比较各基因的表达差异。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。正态分布计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验。计数资料组间比较采用χ2检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象一般情况

MPP组36例，男20例、女16例，中位年龄6.58岁（4.79～8.92岁）；NC组27例，男15例、女12例，中位年龄7.58岁（4.83～8.92岁）。两组性别（χ2=0.00， P=1.000）、年龄（Z=0.67，P=0.510）差异无统计学意义。

2.2 MPP患儿血浆中差异表达的miRNA谱

原始荧光数据进行标准化处理后行t检验，得到差异显著性P值和标准化信号值的差异倍数（fold change，FC）。miRNA表达上调：FC＞2.0且P＜0.05；miRNA表达下调：FC＜0.5且P＜0.05。MPP组外周血筛选出26条差异表达的miRNAs，其中19条miRNAs表达上调（包括miR-27a-3p、miR-424-5p、miR-146b-5p、miR-183-5p、miR-4456、miR-4513、miR-5008-3p、miR-1265、miR-936、miR-3156-3p、miR-222-3p、miR-4445-5p、miR-206、miR-4425、miR-3935、miR-4441、miR-4434、miR-4800-5p、miR-492），7条miRNAs表达下调（包括miR-1255b-2-3p、miR-5704、miR-4511、miR-4725-3p、miR-1184、miR-499a-3p、miR-4800-3p）。见表1。

2.3 miRNA的非监督层次聚类分析

对差异表达的miRNA进行非监督层次聚类分析，同一类样品能通过聚类出现在同一簇中，聚在同一簇的miRNA可能具有相似的生物学功能，用热图展示（图1）。图中MPP组标本标记为29、47、49，NC组标本标记为2、7、8。

图1 芯片结果中差异表达miRNAs的聚类分析

2.4 实时荧光定量PCR检测miR-222-3p 及miR-492表达

NC组miR-222-3p的表达水平为1.000±0.171，MPP组为1.886±0.300；与NC组比较，MPP组中miR-222-3p表达升高，差异有统计学意义（t=14.79，P＜0.001）。NC组miR-492的表达水平为1.000±0.210，MPP组为2.052±0.497；与NC组比较，MPP组miR-492表达升高，差异有统计学意义（t=9.25，P＜0.001）。

表1 MPP组与NC组miRNA差异筛选结果

3 讨论

MP是儿童非典型性肺炎最常见的病原体，感染率随年龄的增长而递增，6岁以上患儿肺炎支原体检出率高达62%。MP每3～4年有一次大流行[4]。社区获得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）中约40%是由MP感染引起，其中约18%需要住院治疗[5]。支原体感染的既往研究以支原体耐药、支原体感染后的气道高反应性及肺外损伤多见。

现今RNA 组学（包括mRNA、miRNA、piRNA、lncRNA 等）已成为研究热点，除了蛋白编码基因，非编码RNA（如miRNA、lncRNA）在基因调控、细胞发育等生命活动中也同样重要，在多个层面调节基因而发挥重要的生物学功能。microRNAs（miRNA）是一类长约21～25个核苷酸、具有调控功能的非编码RNA，以碱基互补配对方式与靶基因mRNA的3’-非编码区（3’-untranslated region，3’-UTR）特异性结合，降解或者阻遏靶mRNA的翻译，实现对基因翻译的调节[6,7]。研究显示，miRNA参与各种生物学功能调控，包括发育、增殖、凋亡、代谢等[6]，miRNA表达异常与多种疾病的发生发展密切相关，如肿瘤形成及耐药、炎症性疾病、感染性疾病等[8-11]。miRNA能够在循环血液中检测到，可作为某些疾病诊断和预后评估的生物学标志物[12]。

本研究应用miRNA芯片技术比较MPP组与NC组儿童外周血血浆中miRNA的表达谱，筛选出26条差异表达的miRNAs，其中19条miRNAs上调，7条miRNAs下调，提示miRNAs参与机体对肺炎支原体的免疫应答反应。选择miR-222-3p及miR-492作为研究对象，采用RT-qPCR方法验证了miR-222-3p及miR-492在MPP组中的高表达，与基因芯片结果相符，提示芯片筛选结果可靠。

目前关于miR-222-3p及miR-492的研究主要在肿瘤领域。在金黄色葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）诱导形成的小鼠急性肺损伤模型中，肺部单核细胞的多个miRNA表达升高，包括miRNA-222[13]；而经3,3'-二吲哚甲烷（DIM）预处理的小鼠肺部炎症、血管渗漏和IFN-γ分泌均减弱，且小鼠肺部的单核细胞miRNAs（包括miR-222）表达谱发生改变，研究首次证明DIM可以改善SEB诱导的急性肺损伤，可能是通过调控包括miR-222在内的miRNAs发挥作用[14]。在肿瘤以外的研究证实，miRNA-492参与高糖诱导的胰岛素抵抗和血管内皮功能障碍[15]及具有潜在的抗血管生成作用，其有望成为抗血管增生治疗的有效手段[16]。本实验为这些差异表达的miRNAs所调控的靶基因参与肺炎支原体肺炎发病机制的研究奠定基础。

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Expression and veri fi cation of miRNAs in peripheral blood of Mycoplasma pneumoniae pneumonia

DING Ying, LEI Xiaoli, SUN Dan, LI Yuqin, CHU Chu, CHEN Zhengrong, JI Wei, ZHOU Weifang（Children’s Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu, China）

ObjectiveTo identify the differentially expressed microRNAs（miRNA）in plasma of Mycoplasma pneumoniae pneumonia (MPP) by miRNA microarray.Methods36 cases of hospitalized children with MPP were enrolled (MPP group).27 cases of healthy children were enrolled as control group (NC group) in the same period.Microarray chip was used to fi nd out differentially expressed miRNAs of plasma from 3 cases with MPP group and 3 cases with NC group.Real-time quantitative PCR was chosen to detect the expression of miR-222-3p and miR-492 in leukocytes from MPP group (n=36) and NC group (n=27).Results26 miRNAs differentially expressed between the two groups were screened out by miRNA microarray assays, of which the expression of 19 miRNAs was elevated, while 7 miRNAs declined.Compared with NC group, the expression of miR-222-3p and miR-492 increased in the MPP group (P＜0.01).ConclusionsSome miRNAs are differently expressed in peripheral blood of MPP patients, which may be involved in the immunopathogenesis of MPP.

Mycoplasma pneumoniae pneumonia; miRNA microarray; child

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.02.003

2016-07-14)

(本文编辑：蔡虹蔚)

苏州市科技计划项目（No.SS201535）

周卫芳 电子信箱：zwf_1969@163.com