黄籽沙逊与黄籽埃塞俄比亚芥种间杂种的鉴定

谭亚飞，张 强，赵艳艳，许 茜，李 扬，原玉香，姚秋菊，蒋武生，魏小春，王志勇，张晓伟

(1.郑州大学 生命科学学院，河南 郑州 450001； 2.河南省农业科学院 园艺研究所，河南 郑州 450002)

黄籽沙逊与黄籽埃塞俄比亚芥种间杂种的鉴定

谭亚飞1，张 强2*，赵艳艳2，许 茜1，李 扬1，原玉香2，姚秋菊2，蒋武生2，魏小春2，王志勇2，张晓伟2*

(1.郑州大学 生命科学学院，河南 郑州 450001； 2.河南省农业科学院 园艺研究所，河南 郑州 450002)

为了把黄籽沙逊的黄籽性状同埃塞俄比亚芥菜的优良特性相结合，在对黄籽沙逊和黄籽埃塞俄比亚芥菜种间远缘杂交的基础上，开展了对种间杂种的形态鉴定、染色体倍性检测、根尖染色体制片和分子标记鉴定研究。形态学鉴定结果表明，黄籽沙逊和埃塞俄比亚芥菜真杂种外观明显不同于其父母本，处于中间类型，更多偏向于父本黄籽埃塞俄比亚芥。总共对 11 株黄籽沙逊与黄籽埃塞俄比亚芥菜种间杂种后代的倍性进行了检测，流式细胞仪分析结果表明，阳性植株DNA相对含量(主峰位置125)明显小于对照黄籽埃塞俄比亚芥DNA相对含量(主峰位置200)，大于亲本黄籽沙逊DNA相对含量(主峰位置75)。细胞学鉴定结果表明，真杂种植株染色体为27条，为黄籽沙逊(AA,2n=20)和黄籽埃塞俄比亚芥菜(BBCC,2n=34)的单倍体染色体相加之和。分子标记鉴定结果表明，真杂种既有父本也有母本的特异性条带。以上均证实了所获得种间杂种的真实性，其包含了双亲中的遗传信息。所获得的含有芸薹属A、B和C 3个亚基因组的种间杂种可作为育种的中间材料应用到甘蓝型油菜的遗传育种研究，具有重要的理论和实践意义。

黄籽沙逊； 埃塞俄比亚芥菜； 黄籽； 种间杂种

芸薹属植物由3个基本种和3个复合种组成，遗传类型极其丰富，变异极其广泛，其中的许多作物既是重要的蔬菜作物，也是重要的油料作物，在人类的生活和农业生产上有着极其重要的作用。种间(远缘)杂交可以打破不同种属间的隔离使之间的基因发生渐渗和交流，是实现优良农艺性状从一个物种向另一个物种转移的重要途径，在创造新物种或新种质以及研究基因组进化方面具有重要意义。在芸薹属作物中已经通过种间杂交创造了许多新的种质资源并育成了一些新的品种[1-6]。

埃塞俄比亚芥(BBCC,2n=34)栽培历史悠久，耐热，耐干旱，抗倒伏，抗黑痉病、白锈病、霜霉病以及萎蔫病等多种病害[6-8]。由于自然界中不存在天然的甘蓝型黄籽油菜资源，因此，埃塞俄比亚芥菜的黄色种皮基因成为油菜育种家们培育甘蓝型油菜的重要基因资源[9-11]。

白菜型油菜具有甘蓝型油菜所不具有的一些优良特性，如较强的抗湿性和抗寒性，迟播早熟、生育期短。因此可以通过黄籽埃塞俄比亚芥和白菜型油菜黄籽沙逊种间远缘杂交来丰富我国黄籽甘蓝型油菜种质资源。过去已有研究者试图通过种间杂交将黄籽埃塞俄比亚芥和白菜型油菜的优良性状相结合，继而转移到现行推广的甘蓝型油菜中[12-14]。黄籽沙逊(2n=20)是原产于印度的一个白菜型油菜，种皮颜色金黄、均一，因黄籽性状十分稳定、不受环境条件的影响而受到育种家的欢迎，被应用到白菜型黄籽油菜种内杂交育种[15-16]和甘蓝型黄籽油菜的种间杂交育种中[17-18]。

为了把黄籽沙逊的黄籽性状同黄籽埃塞俄比亚芥的优良特性相结合，构建具有芸薹属3个基本种基因组的育种中间材料，用于甘蓝型黄籽油菜的遗传育种研究，在利用黄籽沙逊和黄籽埃塞俄比亚芥种间远缘杂交的基础上，开展了对种间杂种的形态鉴定、染色体倍性检测和分子标记鉴定研究等，为后续的育种工作奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2013年秋季至2015年春季在河南省农业科学院原阳实验基地育苗温室和河南省农业科学院园艺研究所分子生物学实验室进行。试验材料印度白菜型油菜黄籽沙逊和黄籽埃塞俄比亚芥，由加拿大曼尼托巴大学栗根义教授惠赠，由河南省农业科学院园艺研究所保存。

1.2 试验方法

1.2.1 种间杂交 2013年秋季，将亲本播种于河南省农业科学院原阳试验田，黄籽沙逊和黄籽埃塞俄比亚芥分别种植，常规栽培管理；2014年春天开花时，以黄籽沙逊为母本，黄籽埃塞俄比亚芥为父本，剥蕾、去雄、授粉做人工杂交，授粉后套袋隔离，严格控制父本以外的花粉污染。将收获的黄熟荚果充分干燥，小心脱粒后于室温贮藏。将经过倍性检测和分子标记检测的植株种植于大田，待2015年春季开花时，观察记载种间杂种的农艺性状。

1.2.2 倍性分析 2014年秋季，将上述收获的杂种种子穴盘播种育苗，取其幼嫩叶片约0.5 cm2放于平面玻璃片上，加400 μL一步法染色剂提取液(核提取液)，使用尖锐的刀片用力先纵后横切割样品，并浸泡2～5 min，之后将样本及液体用滤网过滤到样品管中，再加入1 600 μL的4′,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染液，避光染色2～5 min。利用德国CyFlow Cube植物流式细胞仪，按照仪器操作规程，以黄籽沙逊和黄籽埃塞俄比亚芥的倍性检测结果为对照，分析黄籽沙逊和黄籽埃塞俄比亚芥种间杂交植株倍性。

1.2.3 根尖染色体压片 根尖染色体制片方法参照杜培等的方法[19]。将种子置于铺有湿润滤纸的培养皿中，保持滤纸湿润，25 ℃下培养2～3 d，待种子胚根长1～2 cm时，用刀片切下根尖部分，用对二氯苯饱和水溶液浸泡预处理3 h，卡诺氏固定液固定12～24 h，放入-20 ℃冰箱中待用。采用体积分数为45%的醋酸烘烤法制片，经过冷冻揭片和DAPI(4，6-联脒-2-苯基吲哚)染色分带后，滴10 μL VECT shield胶，盖上盖玻片，荧光显微镜下用450～490 nm波长激发光观察并照像。

1.2.4 分子标记检测 利用2×CTAB法提取植株的基因组DNA，利用针对白菜型油菜黄籽沙逊黄籽性状开发的特异分子标记进行PCR扩增[20]。随后利用ABI3130 XL遗传分析仪对PCR产物快速检测分型，最后利用Genescan和Genographer 软件分析基因型数据。

2 结果与分析

2.1 杂种种子形态和植株性状

杂种种皮颜色为黄色，部分种子浅黄，部分深黄(图1C)。通过田间种植发现，黄籽沙逊和黄籽埃塞俄比亚芥真杂种明显不同于其母本黄籽沙逊(图1A)和父本黄籽埃塞俄比亚芥(图1B)，处于中间类型，更多偏向于父本。在营养生长方面，表现为植株高大直立，生长健壮，主茎发达，表现出明显的杂种优势，叶色浓绿，叶片肥大宽厚无缺刻，叶柄上着生3～4对小叶(图1D)。杂种在开花期分枝较多，开花正常，花蕾为黄色，蜜腺正常但无花粉，表现为明显的三倍体雄性不育特征。

A.黄籽沙逊；B.黄籽埃塞俄比亚芥；C.种间杂种种子；D.种间杂种植株

2.2 杂种的倍性鉴定

对11株黄籽沙逊与黄籽埃塞俄比亚芥菜种间杂种的倍性进行了检测(表1)，在以黄籽埃塞俄比亚芥菜作参照，检测电压为512 V、阈值为0.092 38的情况下，ysca1—ysca3、ysca5—ysca8和ysca10检测到DNA相对含量(主峰位置125)(图2C)，明显小于对照黄籽埃塞俄比亚芥DNA相对含量(主峰位置200)(图2A)，大于亲本黄籽沙逊DNA相对含量(主峰位置75)(图2B)，说明这8株都是三倍体，表现为真杂种；而植株ysca4、ysca9、ysca11检测到DNA相对含量的主峰位置在75，与亲本黄籽沙逊DNA相对含量的主峰位置(图2B)相同，说明这3株为二倍体，为假杂种。

2.3 杂种的根尖染色体数量检测

结果显示，杂交后代的部分植株的染色体为27条，为黄籽沙逊(2n=20)和黄籽埃塞俄比亚芥(2n=34)的单倍体染色体相加之和(图3A，B)，这一方面从细胞水平上证明了所获得种间杂种的真实性，另一方面也说明了获得种间杂种为三倍体，这与田间花蕾雄性不育的表型相一致。但也有部分植株部分表现为亲本黄籽沙逊的染色体条数(2n=20)(图3C)，应为种间假杂种，这与倍性分析仪的检测结果相符。

表1 11株黄籽沙逊和黄籽埃塞俄比亚芥种间杂种的倍性鉴定结果

A.黄籽埃塞俄比亚芥； B.黄籽沙逊； C.种间杂种

A，B.种间真杂种； C.种间假杂种

2.4 杂种的分子标记鉴定

由图4可知，ysca1—ysca3、ysca5—ysca8、ysca10这8个植株同时具有黄籽沙逊的A基因组特异条带(280 bp)、芥蓝或黄籽埃塞俄比亚芥的CC基因组特异条带(270 bp)以及黄籽埃塞俄比亚芥的BB基因组特异条带(295 bp)，而ysca4、ysca9和ysca11仅具有黄籽沙逊的A基因组280 bp的特异条带，这与用倍性分析仪得到的检测结果相同。

1—11.黄籽沙逊和黄籽埃塞俄比亚芥种间杂种植株，即ysca1—ysca11；12—13.黄籽沙逊；14—15.芥蓝；16—17.黄籽埃塞俄比亚芥

3 结论与讨论

甘蓝型油菜(AACC，2n=38)是中国油菜的主栽类型，由于长期的品种间杂交和人工选择，育种亲本材料的遗传背景日渐狭窄，品种的遗传多样性明显降低。油菜籽粒颜色有黑色、褐色和黄色之分。与其他品种相比，黄籽甘蓝型油菜在相同遗传背景下，黄籽含油量高出3%～5%[21]，种皮薄，饼粕中纤维素含量低[22]而蛋白质含量高[23]，且黄籽油色浅，杂质少，清澈透明，减少了加工成本等[24-25]。因此，高产优质的黄籽油菜已经成为当前甘蓝型油菜育种的主要目标之一。甘蓝型油菜中没有天然的黄籽类型，但在芥菜型油菜、白菜型油菜和埃塞俄比亚芥中有大量黄籽材料。在本研究中，尝试把黄籽沙逊的黄籽性状同黄籽埃塞俄比亚芥的优良特性相结合，成功获得了黄籽沙逊与黄籽埃塞俄比亚芥的种间杂种。

在芸薹属植物的远缘杂交中，通常需采用胚和胚珠培养技术克服杂种胚的败育，提高杂种效率[26-28]。孟金陵等[29]发现，埃塞俄比亚芥作母本时虽然较易与白菜型油菜和芥菜型油菜杂交受精，但绝大部分受精胚珠在发育过程中败育，很难获得成熟的杂种种子，而反交中虽然受精频率下降，但可发育的受精胚珠较多，因此可交配性提高。本研究中发现，以黄籽沙逊为母本、黄籽埃塞俄比亚芥为父本时杂交结实比以黄籽埃塞俄比亚芥为母本、黄籽沙逊为父本的反交容易，这与孟金陵等[29]的研究结果相符。这种方法不需胚珠培养或子房培养，大大加快了试验进程。本研究以黄籽沙逊为母本、黄籽埃塞俄比亚芥为父本进行了芸薹属种间远缘杂交研究，结果证明了所获得种间杂种籽粒为黄色，杂种株具有多倍体植株的营养器官巨大性，但表现为雄性不育，因此应为三倍体，对杂种的倍性分析、根尖染色体数量检测和分子标记检测也都证明了这一点，获得的种间杂种具有芸薹属A、B、C 3个基因组。江莹芬等[12]用形态学、细胞学和分子标记技术3种方法对黄籽埃塞俄比亚芥和白菜型油菜远缘杂交的后代进行鉴定，证实了后代的真实性，得到与本研究相类似的结果，并认为形态学鉴定在操作上简单易行。后代的几种鉴定方法中，分子标记鉴定相对于形态学鉴定和细胞学鉴定更快更准确，但在实际生产中可结合几种方法同时进行。由于本研究获得的种间杂种为三倍体，在随后用黄籽沙逊的花粉对三倍体雄性不育株回交授粉时，未能成功结实；对回交授粉7 d后的胚珠培养也未能获得成功。在接下来的研究中，需要对三倍体植株进行秋水仙素染色体加倍处理，在形态学、细胞学和分子生物学鉴定倍性的基础上，再与黄籽沙逊进行回交，以期从杂交后代中选育出甘蓝型黄籽油菜。

[1] 林超,孙萍,程斐,等.芸薹属植物的远缘杂交[J].山东农业科学，2007(4)：27-31.

[2] 周庆红,周灿,范淑英.远缘杂交在芸薹属作物育种中的应用研究进展[J].北方园艺，2015(2)：165-170.

[3] Prakash S,Chopra V L.Introgression of resistance to shattering inBrassicanapusfromBrassicajunceathrough nonhomologous recombination[J].Plant Breeding,1998,101:167-168.

[4] 贾思齐,王超.芸薹属作物远缘杂交子房离体培养的研究进展[J].北方农业学报，2016(3)：110-114.

[5] 杨学乐,陶芬芳,彭烨,等.芸薹属作物远缘杂种优势研究[J].作物研究，2016(5)：520-523.

[6] 熊秋芳,沈金雄,涂金星,等.华中农业大学油菜遗传育种研究五十年[J].中国农业科技导报，2009(6)：1-6.

[7] Kumar A,Singh P,Singh H,etal.Difference in osmo regulation inBrassicaspecies[J].Annals of Botany,1984,54(4):537-541.

[8] Malik R S.Prospects forBrassicacarinataas an oilseed crop in India[J].Experimental Agriculture,1990,26:125-130.

[9] Rashid A,Rakow G,Downey R K.Development of yellow seededBrassicanapusthrough interspecific crosses[J].Plant Breeding,1994,112:127-134.

[10] Meng J,Shi S,Gan L,etal.The production of yellow-seededBrassicanapus(AACC) through crossing interspecific hybrids ofB.campesrtis(AA) andB.carinata(BBCC) withB.napus[J].Euphytica,1998,103:329-333.

[11] 鲁坤存,刘淑艳,郭家保,等.芥甘杂交选育甘蓝型黄籽油菜的研究[J].湖南农业大学学报(自然科学版)，2006(2)：116-119.

[12] 江莹芬,田恩堂,陈伦林,等.埃塞俄比亚芥和白菜型油菜远缘杂种F1的鉴定[J].中国油料作物学报，2007，29(2)：103-106.

[13] 栗茂腾,张椿雨,李宗芸,等.埃塞俄比亚芥与白菜型油菜间六倍体杂种的获得及其生物学特性研究[J].作物学报,2005，31(12)：1579-1585.

[14] 仲裕泉,傅寿仲,浦惠明,等.埃塞俄比亚芥黄种皮性状向甘蓝型油菜的转移研究[J].江苏农业学报，1996(2)：26-31.

[15] Falk K C.ACS-C29 summer turnip rape[J].Can J Plant Sci,2010,90(2):191-192.

[16] Hutcheson D S,Falk K C,Rakow G F W.TR4 summer turnip rape[J].Can J Plant Sci,2000,80(4):837-838.

[17] Rahman M H,Joersbo M,Poulsen M H.Development of yellow-seedBrassicanapusof double low quality[J].Plant Breed,2001,120(6):473-478.

[18] 张锦芳,李浩杰,张雪花,等.甘蓝型油菜SSR标记遗传多样性及其与农艺性状关联分析[J].分子植物育种，2013(5)：502-512.

[19] 杜培,张新友,李丽娜,等.高质量花生根尖细胞染色体制片方法研究[J].河南农业科学，2013，42(3)：31-35.

[20] 李爱民,张永泰,蒋金金,等.芸苔属主要油料作物黄籽性状分子遗传研究进展[J].分子植物育种，2009(2)：407-412.

[21] Daun J K,Declercq R.Quality of yellow and dark seeds inBrassicacampestriscanola varieties Candle and Tobin[J].J Am Oil Chem Soc,1988,65(1):122-126.

[22] Whetten R W,Mackay J J，Sederoff R.Recent advances in understanding lignin biosynthesis[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,1998,49:585-609.

[23] Shirzadegan M,Robbelen G.Influence of seed colour and hull proportions on quality properties of seeds inBrassicanapusL.[J].Fette Seifen Anstrichm,1985,87:235-237.

[24] Slominski B A,Campbell L D,Guenter W.Carbohydrates and dietary fibre components of yellow and brown-seeded canola[J].J Agric Food Chem,1994,42:704-707.

[25] Tang Z L,Li J N,Zhang X K,etal.Genetic variation of yellow-seeded rapeseed lines(BrassicanapusL.) from different genetic sources[J].Plant Breed,1997,116(5):471-474.

[26] 赵德培,张纪增.通过幼胚培养获得结球甘蓝与大白菜的种间杂种[J].中国农业科学,1981，14(2):46-51.

[27] 扈新民,李锡香,梁燕,等.甘蓝与萝卜属间杂交及其胚挽救技术优化[J].中国蔬菜,2009(10):7-12.

[28] 石淑稳,孟金陵.埃塞俄比亚芥与白菜型、甘蓝型和芥菜型油菜杂种子房培养技术的研究[J].武汉植物学研究，1995(1)：8-14.

[29] 孟金陵,吴江生,王萍.埃塞俄比亚芥与白菜、芥菜间的可交配性[J].华中农业大学学报，1992，11(3):203-207.

Identification of Interspecific Hybrid between Yellow Sarson and Yellow Seeded Ethiopian Mustard

TAN Yafei1,ZHANG Qiang2*,ZHAO Yanyan2,XU Qian1,LI Yang1,YUAN Yuxiang2,YAO Qiuju2, JIANG Wusheng2,WEI Xiaochun2,WANG Zhiyong2,ZHANG Xiaowei2*

(1.School of Life Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China; 2.Institute of Horticulture Sciences,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

In order to combine the yellow seed trait of Yellow Sarson with the fine features of Ethiopian mustard,on the basis of interspecific hybridization experiment between Yellow Sarson and yellow seeded Ethiopian mustard,this study carried out morphological identification,chromosome ploidy detection,slide preparation of chromosomes from root tip cells and molecular marker identification for interspecific hybrids.Morphological identification results of hybrid progeny showed that interspecific hybrids between Yellow Sarson and Ethiopia mustard were very different from their parents and belonged to the middle type in appearance,which were more like the maleparent.The results of ploidy analysis by flow cytometry showed that the peak value of positive plants was 125,which was significantly smaller than the main peak of Ethiopia mustard(200),and bigger than the main peak of Yellow Sarson(75).Cytology identification results showed that the real hybrid plants contained 27 chromosomes,which was the sum of the haploid chromosomes number of the Yellow Sarson(AA,2n=20) and Ethiopia mustard(BBCC,2n=34).Molecular markers identification results showed that true hybrids had specific bands of both male and female parents.The results above indicated that the hybrids were real interspecific hybrids,which contained genetic information from both parents.The created hybrids containing the three subgenomes(A,B and C) ofBrassicacan be used as intermediate breeding materials for application in genetic breeding research ofBrassicanapus,which has important theoretical and practical significance.

Yellow Sarson; Ethiopian mustard; yellow seed; interspecific hybrid

2016-11-17

国家自然科学青年基金项目(31101558)；河南省农业科学院优秀青年基金项目(2013YQ14)；农业部黄淮地区蔬菜科学观测试验站项目(河南1020520)

谭亚飞(1987-)，女，河南淮阳人，在读硕士研究生，研究方向：植物生物工程。E-mail:1021698878@qq.com

*通讯作者：张 强(1976-)，男，河南方城人，副研究员，博士，主要从事蔬菜遗传育种工作。E-mail:qiangzh76@163.com 张晓伟(1965-)，男，河南平舆人，研究员，硕士，主要从事蔬菜遗传育种工作。E-mail:xiaowei5737@163.com

S637

A

1004-3268(2017)03-0107-05