聚六亚甲基胍对异育银鲫鳃出血病药效的初步研究

赵 亮，邹益东，胡 鲲，杨先乐，黄保华

(1.上海海洋大学，国家水生动物病原库，上海，201306；2. 江苏天石生物科技有限公司，无锡，214258；3. 上海黛龙生物科技有限公司，上海，201400)

聚六亚甲基胍对异育银鲫鳃出血病药效的初步研究

赵 亮1，邹益东2，胡 鲲1，杨先乐1，黄保华3

(1.上海海洋大学，国家水生动物病原库，上海，201306；2. 江苏天石生物科技有限公司，无锡，214258；3. 上海黛龙生物科技有限公司，上海，201400)

通过PCR检测及序列对比分析，确诊江苏海丰农场两塘口内异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)所患疾病为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ，CyHV-2)引发的鲫造血器官坏死症(Crucian Carp Hematopoietic Necrosis)，而后分别每10 d 使用0.5 mL/m3和0.75 mL/m3聚六亚甲基胍(Polyhexamethylene guanide, PHMG)泼洒治疗，并定期采样，利用Real Time PCR测定样品中病毒表达量。结果显示：该病毒(DF2015) CyHV-2的DNA解旋酶基因序列长为316 bp，与绝大多数病毒株有较近的亲缘关系(99%)，但与病毒株ST-J1和H.Fukuda的亲缘关系相对较远(63%)。与其余病毒株等有较近的亲缘关系(99%)；治疗近2个月后，两塘的病毒相对表达量均呈下降趋势，且具有显著差异性，但0.75 mL/m3治疗塘病毒相对表达量极显著降低，治疗效果相对更显著。

聚六亚甲基胍；异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)；鲫造血器官坏死症；实时荧光定量PCR；鲤疱疹病毒Ⅱ型

异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)是中国重要的淡水养殖鱼类, 养殖规模越来越大[1-4]。2011年，江苏异育银鲫出现一种怪病，引起大量死亡，严重时发病率高达80%，俗称鳃出血病[5]，给江苏地区的水产养殖业造成了严重的经济损失。近年来, 鳃出血病给中国部分水产养殖场带来重创，有研究者确认了该病为鲫造血器官坏死症(Crucian Carp Hematopoietic Necrosis)，其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ，CyHV-2)[6-9]，该病具有突发性及流行广和致死率高的特点。主要症状为体表有大小不同的出血斑, 下颌、鳍基部及侧线鳞以下及胸部出血尤为明显，鳃肿胀呈暗红色, 当鳃盖张合或鱼泳动时会有血液从鳃盖下方流出，鳃出血病严重阻碍中国水产业健康和可持续发展。

已有研究表明0.5 mL/m3聚六亚甲基胍(Polyhexamethylene guanide, PHMG)能够有效预防鲫鳃出血病[10]，聚六亚甲基胍是一种新型的多用途高分子聚合物，具有无色无味、易溶于水、性质稳定等优点[11]，对白色念珠菌、弧菌等具有良好杀灭效果[12-14]。PHMG是一种阳离子表面活性剂，易被呈负电性的各类细菌与病毒所吸附，从而抑制它们的分裂繁殖功能[15]，因其独特的结构与性能，常被用于食品行业及环境消毒等行业中[16-17]。PHMG有刺激性小、安全低毒、易溶解、性质稳定等特点，目前有报道表明PHMG对多种水产养殖疾病具有显著功效[18]。在水产养殖业具有良好的应用前景[10, 19]。本研究欲验证聚六亚甲基胍用于外塘的效果，并为该药在水产养殖的合理安全使用提供科学的参考依据。

2 材料与方法

2.1 实验塘口

江苏大丰海丰农场，一区11#、12#塘为鳃出血发病遗留塘，两塘口面积均约为90 m2，水深约1.5 m。2014年秋季发病后，重新放入了异育银鲫小鱼种。2015年3月底采样时发现鱼体有鳃出血症状，且11#塘相对更严重。随即制定聚六亚甲基胍用药方案，同时带病样回实验室检测。

2.2 实验试剂

聚六亚甲基胍有效浓度约为25%，上海黛龙生物科技工程有限公司。基因组DNA抽提试剂盒、DNA片段纯化试剂盒、rTaq、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)等购自Takara，iQTMSYBR®Green Supermix购自Bio-rad公司。

2.3 实验方法

2.3.1 聚六亚甲基胍用药方案

由于一区11#、12#塘，已发现鳃出血病症状，故首次用药采用治疗方案，具体方案如下：

11#塘：以0.5 mL/m3，每天泼洒一次，连用3 d。

12#塘：以0.75 mL/m3，每天泼洒一次，连用2 d。

而后每10 d按照相应浓度泼洒一次，并分别进行取样检测。

2.3.2 病毒检测

2.3.2.1 样品制备

采集使用聚六亚甲基胍前塘口内的病鱼，每塘取5条，并将两塘病鱼的肾脏组织分别置于无菌离心管中，用无菌剪刀剪碎，液氮研磨后，用于巢式PCR检测，验证是否为CyHV-2病毒感染。

使用聚六亚甲基胍后分批采集病鱼，每次每塘取5条，分别取每批次病鱼肾脏组织于无菌离心管中，用无菌剪刀剪碎，放入冻存管中-80 ℃保存，用于Real Time PCR检测。

2.3.2.2 PCR检测及序列分析

[10, 20]，调整相关条件后，采用巢式PCR检测，引物设计参照GenBank中已有的CyHV-2的DNA解旋酶基因序列(登录号：EU349287)设计。外引物为W1-F：TGAAATGTCAAAAGTGGATGG，W1-R：TATTCCCAGACAGCCTTCAAA；内引物为W2-F：GAACACCGCTGCTCATCATC，W2-R：ACTCTTCGCAAGTCCTCACC[10]，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

巢式PCR两轮扩增后，产物在1%(W/V)的琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统作成像分析。

将上述内引物扩增后的产物用DNA回收试剂盒(TaKaRa)切胶回收纯化后送上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序。测序结果用DNAStar和NCBI BLAST与已发布的CyHV-2基因组序列进行核苷酸同源性序列分析比对。从GenBank中选择与阳性序列相似的参考毒株，用MEGA5.0软件构建系统发育进化树。

2.3.3 Real Time PCR

2.3.3.1 总RNA的提取与反转录

分离异育银鲫肾，按Trizol法提取总RNA。采用紫外分光光度计与1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度及完整性，-80 ℃保存备用。使用M-MLV反转录成cDNA。反转录体系及反应条件按照试剂盒推荐体系进行。

2.3.3.2 Real Time PCR

根据参考文献[21-22]中的引物，参照GenBank中CyHV-2的DNA解旋酶基因序列设计，由上海生工生物有限公司合成，引物如表1。荧光定量PCR反应必须确定扩增的特异性、最适温度及扩增效率。具体要求为：确定最适温度从而使模板与内参基因的扩增可同时进行；目的基因与内参基因的扩增效率必须都介于95%～102%，且差异小于2%[23]。Real Time PCR反应参数为: 95 ℃预变性3 min，95 ℃10 s，64 ℃ 10 s，共40 个循环，最后 72 ℃延伸 1 min。用内参β-actin对各个样品的Ct值进行均一化处理，采用2-△△Ct确定不同样品mRNA的相对含量[24, 25]。

表1 Real Time PCR所用引物

2.4 数据处理

用SPSS19.0软件统计所有数据并进行方差分析(one-way-ANOVA)，差异显著时采用最小显著性差异法(Least Significant Difference，LSD)比较各组平均样，数据表示为均值±标准误差(Mean±SD)。

3 结果

3.1 病毒检测结果

巢式PCR检测到CyHV-2感染，检测结果病鱼均为阳性，这4个样本都能扩增出一条316 bp的单一亮带(图1)。

图1 巢式PCR检测结果Fig.1 CyHV-2 Nested-PCR assay of fish samples.M：DL1000 DNA marker；1、2：11#塘口病鱼；3、4：12#塘口病鱼

3.2 DNA序列比对分析

对上述巢式PCR二次扩增的产物进行了测序，测序结果显示目的基因片段为316 bp，并命名为DF2015。将其在GenBank中进行BLAST比对分析，系统进化树结果分析表明，DF2015与CyHV-2病毒株同为一支，但与CyHV-2病毒株中的ST-J1和H.Fukuda的亲缘关系相对较远，与CyHV-3病毒株等有较近的亲缘关系(图2)。

图2 同源性的系统进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis

3.3 Real Time PCR结果

虽然许多出版单位在数字出版领域进行了探索和发展，并取得了一定的成绩。但如果要想在未来的数字出版领域站稳脚跟、发展壮大，就必须不断开拓创新。数字出版只有在开拓创新中不断摸索、总结经验与教训，大力推进品牌建设，形成自己的运营体系，才能吸引更多的读者群体，出版单位才能在这个领域中站稳脚跟。

用药及取样时间如表2所示，并分别对样品的肾脏进行编号并保存备用。

Real Time PCR结果(图3) 显示，两个塘口用药后病毒mRNA表达量整体趋势为逐渐减少。其中，图3为11#塘样品病毒相对表达量，其它批次样品与第一批样品病毒相对表达量具有显著差异(P<0.05)，同时，11-3批次样品病毒量出现增加的情况(P<0.05)；而图4为12#塘样品病毒相对表达量，与第一批样品病毒相对表达量相比，其它批次样品极显著降低(P<0.01)。

表2 用药、取样时间及样品编号

图3 11#塘样品病毒相对表达量Fig.3 Relative expression of CyHV-2 in fishes of 11#

图4 12#塘样品病毒相对表达量Fig.4 Relative expression of CyHV-2 in fishes of 12#

4 讨论

俞军等[10 ]通过人工感染实验证明，当浓度≥0.5 mL/m3时，PHMG对预防异育银鲫患鳃出血病保护率可达60%以上；而当药物浓度≥0.75 mL/m3时，PHMG对治疗感染3 d后的鲫保护率达63.33%以上。本研究以该研究数据为基础，同时综合分析、考虑成本与效果问题，制定用药方案，进行养殖塘内验证研究，发现每10 d使用0.75 mL/m3PHMG泼洒发病症状较轻的12#塘，相对较每10 d使用0.5 mL/m3PHMG泼洒发病症状较重的11#塘，效果更显著，后期病毒相对表达量降低更显著。与此同时，6月份开始，11#塘出现死鱼情况，约每天死亡100～200尾，而12#只是出现零星死鱼。这可能表明，PHMG浓度高于0.75 mL/m3且在发病初期时，才能更好地抑制病情发展。

据报道，5月份是鳃出血病的爆发期，此时的季节温度适宜CyHV-2 病毒繁殖[5]。因此，11#塘的第三批次样品出现病毒相对表达量增加的情况，可能与当时环境、季节(4月29日)适宜病毒繁殖有关。

另外，由于PHMG的作用机制是通过其自身所带正电荷吸附带负电的物质，而养殖塘内水体复杂，除有害病原外，其它物质是否也会消耗PHMG尚不明确。所以，尽管本研究中所用的两个塘相邻，且日常管理相同，但它们之间水体状况仍可能差异极大，最终防治效果差异是否仅与PHMG使用量有关，需更进一步研究证明。同时，本研究因条件限制，未设置对照塘，因此研究结果或存在一定局限性。

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(责任编辑：邓 薇)

A pilot study of the effect of polyhexamethylene guanide onCarassiusauratusgibeliohematopoietic necrosis

ZHAO Liang1, ZOU Yi-dong2, HU Kun1, YANG Xian-le1, HUANG Bao-hua3

(1.ShanghaiOceanUniversityNationalPathogenCollectionCentreforAquaticAnimals，Shanghai201306，China;2.JiangsuSkystoneBiotechnologyCo.,LTD，Wuxi214258，China；3.ShanghaiDelonBiologicalEngineeringTechnologyCo.,LTD，Shanghai201400，China)

Using nested-PCR assay and the amplification product assay, we decided the disease ofCarassiusauratusgibelioin two areas of Jiangsu Haifeng Farm is caused by Cyprinid herpesvirusⅡ(CyHV-2), and then respectively treated with 0.5 mL/m3and 0.75 mL/m3Polyhexamethylene guanide (PHMG) each 10 days, sampled regularly, and eventually evaluated the relative expression of CyHV-2 by Real Time PCR. The results showed that the sequence of virus’ CyHV-2 DNA helicase gene is 316bp，and forms an independent branch on the phylogenetic tree with other CyHV-2 strains. After two months treatment, relative expression of CyHV-2 of both treatments decreased significantly, and relative expression of CyHV-2 of the one treating with 0.75 mL/m3PHMG decreased more significantly, and the efficiency is much better.

polyhexamethylene guanide;Carassiusauratusgibelio; crucian carp hematopoietic necrosis; real time PCR; cyprinid herpesvirusⅡ

2016-04-05；

2016-07-21

国家重大科技成果转化项目(ZD-2012-345)；上海高校知识服务平台项目(ZF1206)；公益性行业(农业)科研专项经费(201203085)；国家863计划项目(2011AA10A216)；国家自然科学基金资助项目(31172430)

赵 亮(1986-)，男，硕士研究生，专业方向为水产动物医学。E-mail:574219289@qq.com 通讯作者：杨先乐。E-mail:xlyang@shou.edu.cn

S948

A

1000-6907-(2017)02-0096-05