CETP基因多态性及单倍型与蒙古族人群原发性高血压的关系*

2017-04-06牛淑冬陶晓明李宇刘勇跃王建丛明宇周文郁邱长春

中国现代医学杂志 2017年6期

牛淑冬，陶晓明，李宇，刘勇跃，王建，丛明宇，周文郁，邱长春

（1.齐齐哈尔医学院基础医学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.中国医学科学院基础医学院，北京 100005；3.内蒙古自治区通辽市疾病控制和预防中心流行病学教研室，内蒙古通辽 028099；4.齐齐哈尔医学院医药科学研究院，黑龙江齐齐哈尔 161006）

牛淑冬1，陶晓明2，李宇1，刘勇跃3，王建3，丛明宇1，周文郁2，邱长春4

目的分析胆固醇酯转运蛋白（CETP）基因TaqIB、D442G、I405V多态性及其单倍型与中国蒙古族人群原发性高血压（EH）的相关性。方法从内蒙古自治区随机选取高血压患者883例、健康对照1044例进行病例对照研究。应用聚合酶链反应（PCR）和PCR产物直接测序法鉴定多态性位点的基因型，采用Haploview进行Hardy-Weinberg平衡和单倍型分析。结果 TaqIB、D442G2、I405V基因型及等位基因的分布在EH组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；但B2-G、B2-G-I单倍型在EH组中的分布频率低于对照组[B2-G：＾OR= 0.359（95%CI：0.188，0.689）P=0.001；B2-G-I：＾OR=0.329（95%CI：0.157，0.691）P=0.002]。结论在中国内蒙古自治区蒙古族人群中，CETP基因TaqIB、D442G、I405V 3个位点的突变不能独立影响EH发病风险，但单倍型B2-G、B2-G-I携带者的EH发病风险显著降低，可能是降低该人群EH易感性的保护性因素。

原发性高血压；胆固醇酯转运蛋白基因；基因多态性；单倍型；蒙古族

人类胆固醇酯转移蛋白（cholesterol ester transfer protein，CETP）基因位于第16号染色体长臂（16q12 21），长约25 kb，包含16个外显子和15个内含子。研究表明，CETP基因中有多个多态性位点可能与脑卒中、冠状动脉粥样硬化性心脏病等心血管疾病相关[1-2]。目前关于CETP基因多态性及其血浆水平与三酰甘油（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）等血脂水平改变的相关性研究较多[3-4]，但CETP基因多态性对于心血管疾病另一主要风险因素——高血压的影响却鲜见报道。本课题以原发性高血压（essential hypertension，EH）发病率高居我国各民族第3位（20.22%）的内蒙古自治区蒙古族人群为研究对象，经年龄、性别、体重指数（body mass index，BMI）、吸烟、饮酒、血脂水平等混杂因素调整，应用多因素Logistic回归分析，观察CETP基因常见多态性位点TaqIB、D442G2、1405V与EH的相关性，旨在探讨CETP基因多态性对我国蒙古族人群EH易感性的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究获得中国医学科学院及齐齐哈尔医学院医学伦理委员会的批准和受试者的知情同意，以内蒙古自治区通辽市科左后旗32个自然村作为研究现场，随机抽取年龄≥40岁，且≥3代无异族通婚史的常住蒙古族人为研究对象，经问卷调查和体格检查，纳入高血压患者883例（男性453例，女性430例），健康对照1044例（男性372例，女性672例）。

高血压患者纳入标准以1999年世界卫生组织/国际高血压联盟制定的高血压诊断标准为依据[5]：①患者之间无血缘关系；②发病年龄＜60岁；③收缩压（systolic blood pressure，SBP）≥140 mmHg和/或舒张压（diastolic blood pressure，DBP）≥90 mmHg；④根据详细询问病史、体格检查和实验室检查，排除继发性高血压、糖尿病及肝、肾疾病患者。

对照组纳入标准：按年龄、性别与地区匹配的原则，选择无血缘关系的血压正常受试者。①SBP＜130 mmHg，DBP＜80 mmHg；②对照组受试者与EH组受试者性别相同，年龄差别＜5岁，近5年居住在同一自然村；③根据病史、体格检查和实验室检查，排除糖尿病及肝、肾疾病患者。

1.2 人体测量与生化检测

人体测量指标包括SBP、DBP、身高、体重、腰围和臀围。计算BMI、腰臀围比（waist-hip ratio，WHR）。BMI=体重/身高2（kg/m2），WHR=腰围（cm）/臀围（cm）。血压测量按照国际标准化方法，使用台式汞柱血压计，每位研究对象连续测量血压3次，取平均值作为被测对象的血压值。血液样本收集与生化指标测定：空腹抽取静脉血5 ml置于10 ml抗凝管中（含1 ml 2%EDTA-Na2），用于测定血液生化指标及基因组DNA提取；采用酶法（自动生化仪ErbaXL-300，德国Diagnostics Mannheim GmbH公司）测定血浆总胆固醇（total cholesterol，TC）、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.3 全血基因组DNA提取及基因型鉴定

采用离心柱型试剂盒法（TIANamp blood DNA midi kit，北京天根生化科技有限公司），从白细胞中提取基因组DNA（OD260/OD280约为1.80），置于-20℃冰箱冷冻保存备用。应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）（PCR仪：MyCycler Thermal Cycler，美国Bio-Rad公司）和PCR产物直接测序（BGI北京LifeTech公司）鉴定TaqIB、D442G、1405V基因型。PCR反应引物序列见表1。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用独立样本t检验，方差不齐采用t'检验，对明显偏态分布的变量先进行算术平方根转换。等位基因、基因型、单倍型频率的比较用χ2检验。Hardy-Weinberg平衡和单倍型分析采用Haploview软件。应用Logistic回归分析进行混杂因素调整及基因型与血压水平关系分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 CETP基因多态性位点引物序列

2 结果

2.1 临床特征

EH组与对照组的吸烟者比率、饮酒者比率、BMI、WHR、SBP、DBP及血浆TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，EH组的吸烟者比率、饮酒者比率、BMI、WHR、SBP、DBP、TC、TG、LDL-C水平高于对照组，而HDL-C水平低于对照组。见表2。

表2 两组患者临床特征和生化指标比较

表3 两组CETP基因型与等位基因频率分布比较例（%）

2.2 两组基因型与等位基因频率分布比较

TaqIB的3种基因型（B1B1、B1B2、B2B2）和I 405V的3种基因型（Ⅱ、Ⅳ、VV）在EH组和对照组中均有分布；而D442G多态性位点只有DD和DG基因型，在整个人群中，均无GG突变纯合子携带者。3个位点的基因型及等位基因的分布频率在EH组与对照组比较，经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表3），按性别分组及应用二分类回归分析，校正年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒、血脂水平后差异无统计学意义。

2.3 两组单倍型分布频率比较

将TaqIB、D442G、I405V 3个位点两两组合，观察其分布频率及在EH组与对照组中的分布差异。结果表明，TaqIB-D442G 4种单倍型分布频率均＞1%，其分布频率由高至低依次为B1-D（57.5%）、B2-D（39.8%）、B1-G（1.4%）、B2-G（1.3%）；TaqIB-I405V 4种单倍型分布频率均＞1%，其分布频率依次为B1-I（44.5%）、B2-V（28.6%）、B1-V（14.6%）、B2-I（12.4%）；D442G-I405V有3种单倍型分布频率均＞1%，其分布频率依次为D-I（54.4%）、D-V（42.8%）、G-I（2.0%）。以上各种单倍型中，B2-G单倍型在EH组与对照组中的分布频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），EH组的分布频率低于对照组。见表4。

续表3

表4 CETP基因单倍型分布频率比较例（%）

TaqIB-D442G-I405V组合的6种单倍型分布频率均＞1%，其分布频率由高至低依次为B1-D-I （43.2%）、B2-D-V（28.3%）、B1-D-V（14.3%）、B2-DI（11.5%）、B1-G-I（1.1%）、B2-G-I（1.1%）。其中B2-G-I在EH组与对照组中的分布频率比较（P＜0.05），差异有统计学意义，EH组中的分布频率低于对照组。见表4。

3 讨论

心脑血管疾病是人类首位死亡原因。前瞻性流行病学调查结果显示，罹患心血管疾病的危险性不仅取决于个体具有某一危险因素的严重程度，更取决于个体同时具有危险因素的数目[6]，危险因素的数目和严重程度共同决定个体发生心血管疾病的危险程度。多种危险因素的共同作用称为多重危险因素的综合危险。高血压、血脂异常（包括低HDL-C、LDLC、TC、TG水平升高等）是主要的心血管风险因素[7]，且在疾病发生、发展的过程中，高血压与血脂异常相互作用，提高心血管疾病的发病风险。作为目前唯一已知具有胆固醇逆向转运（reverse cholesterol transport，RCT）功能的蛋白质，CETP因其对于体内脂质转运及脂蛋白组成的重要影响，而得到广泛的关注和研究。然而一项关于CETP抑制剂的研究发现，CETP基因多态性可能与EH发病风险相关[8]，因此，CETP基因多态性在影响血脂水平的同时是否也影响血压水平成为一个令人关注的问题。

3.1 TaqIB、D442G、I405V多态性及其种族差异性

大量研究表明，CETP基因启动子区、内含子区、外显子区、3’调控区的多个多态性位点可能与CETP表达水平、血脂水平及心血管疾病风险相关[1，3]。

TaqIB（rs708272）是第1内含子第277位核苷酸的G/A突变，该突变导致Taq IB酶切识别位点消失。具有酶切位点的等位基因称为B1，而失去酶切位点的等位基因则称为B2。该突变在各种族人群中普遍存在，如美国白人分布频率为0.42[9]，日本人为0.39[10]，中国台湾地区人群为0.42[11]。本研究结果显示，内蒙古自治区蒙古人群分布频率为0.41；D442G （rs2303790）是外显子15第55个核苷酸碱基的A/G突变，导致CETP第422位天冬氨酸（aspartic acid，Asp）被甘氨酸（Glycine，Gly）取代。该突变以杂合子的个体较为多见，且在亚洲人群中较为常见，而在欧美白人中尚未见报道。亚洲人群中，又以日本人群分布频率最高，一般群体可达0.08[12]，而中国汉族一般人群约为0.02[13]。本研究结果显示，内蒙古自治区蒙古人群突变率约为0.03；I405V为CETP基因第14外显子第405密码子中的A/G突变，该突变导致表达产物异亮氨酸（Isoleucine，I）变为缬氨酸（Valine，V），405V等位基因的频率在非裔美国人群和亚洲人群的分布分别为0.61和0.62，白种人为0.32[14]。本项研究结果显示，内蒙古自治区蒙古人群突变率为0.43。

3.2 TaqIB、D442G、I405V多态性与原发性高血压

2010年，SCHECHTER等[8]通过对1998～2003年搜集的CETP多态性研究资料的分析发现，CETP基因I405V突变引起CETP活性降低、血清HDL-C水平升高，并可显著降低高血压风险。根据文献检索的结果，这是首次关于CETP基因多态性与EH的相关性的报道。本研究选择TaqIB、D442G、I405V 3个常见多态性位点进行与EH相关性的分析，结果显示，TaqIB、D442G、I405V与中国蒙古族EH无关。由于CETP基因型与表型之间的关联可能受吸烟、饮酒、性别等因素的影响[15]，本研究应用二分类回归分析校正年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒、血脂水平，结果表明，TaqIB、D442G、I405V基因型及等位基因分布在EH组与对照组比较，差异无统计学意义，提示上述多态性位点的突变不能独立影响蒙古族人群EH发病风险。

3.3 TaqIB、D442G、I405V单倍型与原发性高血压

大量基因关联研究显示，在EH等多基因复杂疾病的病因学研究中，单个位点多态性的作用可能会由于其他与之连锁不平衡的位点的影响而被混淆，连锁不平衡分析及单倍型分析对于基因型-表型的关联研究可能会更为有效。本研究结果显示，在EH组与对照组，TaqIB与D442G、TaqIB与I405V均存在较弱的连锁不平衡，D442G与I405V则有中度的连锁不平衡，因此，本研究分析3个位点的两两组合单倍型和3位点单倍型对EH易感性的影响，结果表明，单倍型B2-G、B2-G-I携带者EH发病风险降低，可能是降低EH易感性的保护性因素。

目前，CETP基因多态性降低EH发病风险的机制还不清楚，推测可能与下述因素有关：①CETP基因多态性导致内皮细胞内CETP表达水平降低，对内皮细胞的功能起到保护性调节作用；②CETP基因多态性改变血脂水平及其各成分的比例、结构，具有抗动脉硬化作用，进而保护动脉管壁的弹性和对血压的缓冲功能[8]。

近年来，大量证据显示，遗传性CETP低水平具有调脂及降低心、脑血管疾病风险的效应。因此，CETP抑制剂已成为心血管系统新药开发的热点[16]。尽管CETP抑制剂可提高HDL-C水平，降低LDL-C水平，但是关于CETP抑制剂是否能降低动脉粥样硬化和心血管疾病发病率，目前仍有争议。有研究表明，CETP抑制剂的调脂效果与CETP基因多态性应相关，但CETP基因多态性与血压的相关性尚不确定[8，17]。通过了解CETP抑制剂的临床效应与CETP基因多态性的关系，可进一步明确CETP抑制剂的疗效和临床应用范围。因此CETP基因多态性与血脂、血压的相关性不仅是心血管疾病病因学研究的内容之一，也是CETP抑制剂临床应用的重要理论支撑。

本研究以人口流动性小、遗传背景单纯、稳定，生活环境及生活习惯一致的内蒙古自治区蒙古族人群为研究对象，降低人群分层的影响，可有效提高研究结果的准确性。对照组血压＜130/80 mmHg，可降低选择性偏倚，保证结果的准确性。但由于B2-G和B2-G-I在人群中分布频率较低，拟在进一步研究中扩大研究位点的范围，并分析各位点的联合效应，以期更深入的了解CETP基因多态性与EH的关系。

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（童颖丹编辑）

Associations ofCETPgene polymorphisms and haplotypes with essential hypertension in Chinese Mongolian population*

Shu-dong Niu1,Xiao-ming Tao2,Yu Li1,Yong-yue Liu3,Jian Wang3, Ming-yu Cong1,Wen-yu Zhou2,Chang-chun Qiu4
(1.College of Basic Medical Sciences,Qiqihar Medical University,Qiqihar,Heilongjiang 161006,China;2.Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100005,China;3.Department of Epidemiology,Tongliao Center for Disease Control and Prevention,Tongliao,Inner Mongolia Autonomous Region 028099,China;4.Research Institute of Medical Pharmacy,Qiqihar Medical University,Qiqihar, Heilongjiang 161006,China)

ObjectiveTo explore the associations of cholesteryl ester transfer protein (CETP)gene TaqIB, D442G and 1405V polymorphisms and haplotypes with essential hypertension (EH)in Chinese Mongolian population.Methods In this case-control study,883 hypertensive patients (EH group)and 1,044 normal controls (controlgroup)were randomly selected from the InnerMongolia Autonomous Region,China. Polymerase chain reaction (PCR)and direct sequencing of PCR product were used to identify the genotypes. Hardy-Weinberg (H-W)equilibrium and haplotypes distribution were analyzed using the Haploview software.Results There were no significant differences in the distributions of the alleles or genotypes of TaqIB,D442G or 1405V between the EH group and the control group (P＞0.05);while the distribution frequencies of B2-G and B2-G-I haplotypes were significantly lower in the EH group than in the control group [B2-G: ＾OR= 0.359 (95%CI:0.188,0.689),P=0.001;B2-G-I: ＾OR=0.329 (95%CI:0.157,0.691),P=0.002]. Conclusions The TaqIB,D442G and 1405V polymorphisms of theCETPgene could not independently affect the risk of developing EH in Mongolian population,while B2-G and B2-G-I haplotypes obviously decrease the susceptibility to EH and may be protective factors for the development of EH in Mongolian population.

cholesteryl ester transfer protein gene;essentialhypertension;polymorphism;haplotype; Mongolian population

R544.1

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.008

1005-8982（2017）06-0038-06

2016-03-31

国家自然科学基金（No：31440054、31371208）；美国中华医学基金（No：CMB96-657）；北京市自然科学基金重点项目（No：7001004）

邱长春，E-mail：changchun_qiu@163.com；Tel：0452-2663389