大白猪FSHβ和RBP4基因多态性与繁殖性状的相关性研究

胡闪耀，陈 佳，姜佳佳，毛 翠，毛慧敏，王利通，王国水，左 波，徐在言*

（1.华中农业大学动科动医学院农业部猪遗传育种重点实验室，湖北 武汉 430070；2.浙江天蓬集团有限公司，浙江 江山 324111；3.山东省荣成市俚岛镇俚岛畜牧兽医站，山东 荣成 264317）

大白猪FSHβ和RBP4基因多态性与繁殖性状的相关性研究

胡闪耀1，陈 佳3，姜佳佳2，毛 翠2，毛慧敏2，王利通2，王国水2，左 波1，徐在言1*

（1.华中农业大学动科动医学院农业部猪遗传育种重点实验室，湖北 武汉 430070；2.浙江天蓬集团有限公司，浙江 江山 324111；3.山东省荣成市俚岛镇俚岛畜牧兽医站，山东 荣成 264317）

分子标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS）相对于传统的育种技术，在早期选择、选择准确性等方面具有显著的优越性。该研究以633头美系大白猪和963头法系大白猪为研究对象，利用PCR-RFLP技术对FSHβ和RBP4基因的多态性进行检测，并进行关联分析。研究结果表明：在美系和法系大白猪中均检测到FSHβ和RBP4基因存在三种基因型（AA、AB和BB基因型）；在美系初产和经产大白母猪中，FSHβ基因BB基因型个体的总产仔数、健仔数和初生窝重均显著高于AA基因型个体（P＜0.05）；在美系和法系大白猪中，初产和经产母猪RBP4基因BB基因型个体的总产仔数、健仔数和初生窝重均显著高于AA基因型个体（P＜0.05）。然而，FSHβ和RBP4基因研究结果与现有报道不尽一致，其用于大白母猪育种工作还有待进一步验证。

猪；FSHβ；RBP4；单核苷酸多态性；关联分析

1 前言

提高产仔数是增加猪肉产量的前提基础，因此，通过分子育种技术寻找与猪产仔数相关的候选基因，对于提高母猪产仔数及养猪业的经济效益具有重要意义。通过候选基因法等途径，FSHβ和RBP4等影响母猪繁殖性能的候选基因相继被发现，并在不同猪种中进行了多态性研究。

促卵泡β亚基（Follicle stimulating hormone beta subunit，FSHβ）是促卵泡激素的两个亚基之一，也是促卵泡激素行使生物功能的主要依赖者。在哺乳动物体内，卵泡的形成和发育与FSHβ关系密切，FSHβ可以影响卵泡的数量，刺激卵泡成熟，并诱导排卵。赵要风等首次证明FSHβ基因座在大白、长白和杜洛克中与影响猪产仔性能的主效基因连锁，并发现在该基因的第1内含子，靠近第2外显子处（具体位置在其DNA序列的809 bp和810 bp之间）存在一个292 bp片段的插入性突变位点[1]。此后，FSHβ基因及该突变位点对母猪繁殖性状的影响就一直成为研究热点。但是，该突变位点对母猪繁殖性能的遗传效应，在不同群体中的研究结果却不尽一致。在大白、长白和杜洛克猪中BB基因型个体的产仔数要显著高于AA基因型个体，而在莱芜猪、北京黑猪等部分中国地方猪种中则表现为AA基因型个体产仔数高于BB基因型个体[2-4]。另外，在FSHβ基因的Intron1内还存在一个HaeIII酶切位点多态性，与母猪产仔性状显著相关[5-6]。这些研究结果都为FSHβ基因在猪育种中的应用提供了一定的理论依据。

视黄醇结合蛋白4（Retinol binding protein 4，RBP4）是生物体内负责结合、转运维生素A（VA）即全反式视黄醇及其衍生物的一种转运蛋白。RBP4作为4种视黄醇结合蛋白结构形式中的一种，参与维生素A的转运代谢、胚胎早期发育等过程。另外，有研究发现RBP4在卵黄囊中有助于视黄醇在胚胎和母体间的转运，也证明了RBP4基因对胚胎的发育具有重要作用。Messer等研究发现RBP4基因与猪繁殖性能相关，揭示该基因可能是影响猪繁殖性状的候选基因[7]。随后，Rothschild等在RBP4基因的第4外显子发现一个MspI酶切位点存在多态性，与产仔数的关联分析结果表明，RBP4基因对猪产仔数具有显著的遗传效应[8]。近几年的相关研究发现，该突变位点在外来猪种（大白、长白、杜洛克）和中国本地猪种（民猪、莱芜黑猪、里岔黑猪、鲁莱黑猪）中均表现出一致的遗传效应，即AA基因型个体的产仔性能要显著高于AB和BB基因型个体[9-10]。这些报道再次证明该突变位点可以显著影响母猪的产仔性能，具有提高母猪繁殖性能的应用潜力。

2 材料与方法

2.1 实验材料

美系大白猪633头、法系大白猪963头和6月龄法系大白猪组织样9头（采自浙江开盛生态农业发展有限公司）。基因组DNA采用血液基因组DNA中量提取试剂盒（离心柱型）提取，于-80 ℃超低温冰箱中保存。

2.2 基因型检测

本研究主要利用PCR-RFLP技术进行基因分型，所用引物分别根据戴丽荷（2013）和刘璐（2012）发表的引物序列合成引物，各个所用引物的长度、退火温度等如表1所示。

PCR扩增反应扩增体系和程序如表2所示。

酶切反应体系及条件见表3。

反应结束后，用3.0%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照保存图片，统计基因型。其中，FSHβ基因由于是片段插入性突变，可以通过PCR产物直接电泳检测，进行基因型统计。

2.3 分子标记的基因效应分析

本研究采用线性模型对性状表型进行校正，并将校正后表型用于标记效应的估计。采用SAS软件GLM模型自编程序完成。同时采用reg程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验。所采用模型为：

Tijkl为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应（包括基因加性效应和显性效应）；Fj、Yk、Pl、Am为固定效应，分别为家系、季度、胎次、场次效应，eijklm为残差效应。

3 结果与分析

3.1 猪FSHβ基因的遗传变异及其对繁殖性状的影响

3.1.1 FSHβ基因的PCR多态性检测

FSHβ基因第1内含子区的突变形式是292 bp片段的插入缺失性突变，通过PCR产物直接电泳就可以进行基因型检测。利用1.5%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，检测到产生三种基因型分别命名为：AA型（500 bp），AB型（500 bp+200 bp），BB型（200 bp），结果如图1所示。

表1 基因分型引物

表2 PCR扩增体系和程序

表3 PCR-RFLP反应体系及条件

图1 FSHβ基因PCR产物电泳分型结果

表4 FSHβ基因Intron1片段插入性突变在大白猪群中的多态性

表5 FSHβ基因多态性与美系大白猪繁殖性状的关联分析

3.1.2 FSHβ基因在大白猪群体中的基因频率

FSHβ基因第1内含子292 bp的片段插入性突变在美系和法系大白猪群体中都存在多态性，基因型统计结果见表4。

从统计结果可以看出，在这两个大白猪群体中，BB基因型频率都远远高于AA基因型。等位基因B的频率在美系大白和法系大白猪中，分别是A等位基因频率的3.65倍和7.3倍，说明在这两个群体中B等位基因是优势等位基因。

3.1.3 FSHβ基因多态性与大白猪繁殖性能的关联分析

分别在美系和法系大白猪群体中，对FSHβ基因多态性与繁殖性状进行关联分析，分析统计结果见表5和表6。

从表5可以看出，对美系大白初产母猪，BB基因型个体的总产仔数、健仔数和初生窝重均高于AA基因型个体，且差异显著（P＜0.05）；对美系大白经产母猪，FSHβ基因BB基因型个体的总产仔数、健仔数和初生窝重均高于AB和AA基因型个体，其中AA基因型与BB基因型个体的总产仔数和健仔数差异显著（P＜0.05），初生窝重差异则不显著。

由表6可以看出，在法系大白猪群体中，初产和经产母猪BB基因型个体的总产仔数、健仔数及出生窝重都高于AB基因型个体，但差异不显著。综合来看，FSHβ基因的B等位基因对初产和经产大白母猪的总产仔数及健仔数具有显著的加性效应，而对初生窝重则没有显著影响。

3.2 猪RBP4基因的遗传变异及其对繁殖性状的影响

3.2.1 RBP4基因的PCR-MspIRFLP多态性检测

RBP4基因PCR产物（550 bp）如图2所示，用Mspl酶切后，利用3%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。酶切电泳检测到3种基因型分别为：AA型有190 bp、154 bp和136 bp三条带；BB型有190 bp、136 bp和125 bp三条带；AB型有190 bp、154 bp、136 bp和125 bp四条带，电泳结果见图3。

3.2.2 RBP4基因在大白猪群体中的基因频率

对RBP4基因在大白猪两个品系中的基因型进行检测，并对基因频率分布情况进行统计，详细统计结果如表7所示。

表6 FSHβ基因多态性与法系大白猪繁殖性状的关联分析

图2 RBP4基因PCR电泳结果

图3 RBP4基因PCR-MspI-RFLP酶切分型结果

表7 大白猪RBP4基因MspI-RFLP基因型频率和等位基因频率

表8 RBP4基因MspI多态性与美系大白猪繁殖性状的关联分析

表9 RBP4基因Msp I多态性与法系大白猪繁殖性状的关联分析

表7统计结果显示，RBP4基因MspI酶切位点在两个品系中均存在多态性，且基因频率分布差异较大。在美系大白猪中，B等位基因频率显著高于A等位基因，而在法系大白猪中A、B两种等位基因的频率则很接近。这也有可能是造成两个品系繁殖性能产生差异的原因之一。

3.2.3 RBP4基因多态性与大白猪繁殖性能的关联分析

对RBP4基因MspI酶切位点多态性与大白猪总产仔数、健仔数、初生窝重等指标进行关联分析，美系和法系大白猪的分析结果分别见表8和表9。

从表8的关联分析结果可知，RBP4基因多态性与美系大白猪的总产仔数及健仔数存在显著的关联性。在初产和经产母猪中，BB基因型个体的总产仔数和健仔数均高于AB和AA基因型个体，且AA基因型和BB基因型个体间差异显著（P＜0.05）；同时，BB基因型个体的初生窝重也均高于AB和AA基因型个体，但只在初产母猪中差异显著（P＜0.05），在经产母猪中差异不显著。

从表9中可以看出，RBP4基因的B等位基因只对法系大白母猪的总产仔数和初生窝重具有显著的加性效应，在初产和经产母猪群体中，BB基因型个体的总产仔数、健仔数和初生窝重都显著（P＜0.05）高于AA基因型个体，而AA基因型个体与AB基因型个体间的差异则不显著。结合美系大白猪的分析结果可知，RBP4基因的B等位基因在提高初产和经产母猪的繁殖性能方面为有利等位基因。

4 讨论

繁殖性状对猪生产成本和经济回报具有重要影响，产仔数又是衡量母猪繁殖性能的重要指标之一[11]，因此，提高母猪繁殖性能对于提高养猪业的经济效益具有重要意义。分子遗传标记的发现为提高母猪产仔数提供了新的育种手段，研究单个基因或分子标记对繁殖性状的遗传效应，可以更加精确地选择产仔性状[12]。经过多年的QTL定位和关联分析研究，在商品猪中鉴定出了FSHβ、RBP4等一些影响母猪繁殖性能的候选基因[13-15]。本研究在大白猪群体中对FSHβ和RBP4基因多态性与母猪的繁殖性能的关系进行了研究。

4.1 FSHβ基因多态性与大白母猪繁殖性能的关联分析

本研究利用PCR技术在美系和法系大白猪中，对FSHβ基因Intron1中292 bp片段插入性突变的多态性进行检测，且在两个群体中均检测到三种基因型存在。基因频率统计结果显示B等位基因频率在两个品系中均达到了0.75以上，显著高于A等位基因，这与FSHβ基因在外来猪种（大约克、长白、杜洛克）中以B等位基因占优势的报道是一致的[1-2]。分析可能是外来猪种长期对高产个体的选留导致B等位基因频率逐渐升高。

FSHβ基因对母猪繁殖性状的遗传效应分析显示，B等位基因是提高大白母猪总产仔数、健仔数和初生窝重的有利等位基因。在美系大白猪中，三种基因型个体的总产仔数、健仔数和初生窝重均呈现BB基因型高于AB和AA基因型的变化趋势，且AA和BB基因型个体间的差异达到显著水平。说明FSHβ基因的B等位基因对提高美系大白母猪的繁殖性能具有显著的加性效应。在法系大白初产和经产母猪中，BB基因型个体的总产仔数和初生窝重均高于AB基因型个体，但差异都没有达到显著水平。

综合来看，本研究结果与FSHβ基因在商业猪种中的相关研究报道一致[6]。但是也有研究报道称，在部分中国地方品种（莱芜黑猪、北京黑猪和宗地花猪）中A等位基因是提高母猪繁殖性能的有利等位基因[3-4]。虽然，有关FSHβ基因变异对母猪繁殖性能的影响在不同猪种中的研究报道不一致，但本研究显示，在美系大白猪中，FSHβ基因的BB基因型个体的总产仔数显著高于AA基因型个体。由此推断，B等位基因可以显著提高美系大白母猪的产仔性能。由于在法系大白群体中检测到的AA基因型个体很少，无法进行基因型与产仔性状的关联分析，今后还需要进一步扩大法系大白检测群体，进一步分析FSHβ基因变异对法系大白母猪繁殖性能的影响。

4.2 RBP4基因多态性与大白母猪繁殖性能的关联分析

本研究利用PCR-MspI-RFLP技术，对RBP4基因在美系和法系大白猪中的多态性进行了检测，从基因频率分布情况看，在美系大白猪中B等位基因为优势等位基因，频率为0.84；在法系大白猪A等位基因为优势等位基因，频率为0.51。推测这可能与RBP4基因在不同品系中的分布情况不同有关。

RBP4基因的关联分析结果显示，在美系和法系大白初产及经产母猪中，三种基因型个体的总产仔数和初生窝重均呈现BB基因型个体高于AB和AA基因型个体的变化趋势，且AA基因型和BB基因型个体间的差异都达到了显著水平（P＜0.05）。从本研究结果来看，在美系大白和法系大白两个群体中，携带B等位基因的个体具有更高的总产仔数、健仔数和初生窝重，这与刘璐等人的研究结果一致[16]。但也有研究报道称，RBP4基因的AA基因型个体比BB基因型个体具有更高的总产仔数和产活仔数[9-10]。可见，RBP4基因对母猪繁殖性能产生的遗传效应在不同群体中并不一致。因此，还需要在美系和法系大白母猪中扩大试验群体，增加繁殖性状数据，进一步分析RBP4基因对这两个群体繁殖性能的影响，为RBP4基因在大白母猪标记辅助选择中的应用提供更加准确的理论基础。

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2016-12-20）

本项目受到国家科技支撑计划（项目编号：2014BAD20B01）、浙江省重大科技专项（项目编号：2014C02010）、中央高校基本科研业务费专项（项目编号：2014PY038；2662016PY012）资助

胡闪耀（1988-），男，河南平顶山人，硕士，主要从事动物遗传育种与繁殖方面研究

*通讯作者：徐在言，华中农业大学，动科动医学院副教授，E-mail：xuzaiyan@mail.hzau.edu.cn