双阻滞位点特异性PCR鉴别铁皮石斛及其近缘物种

董晓曼+蒋超+袁媛+查良平+彭代银+赵玉洋

[摘要]建立一种快速、准确鉴别铁皮石斛加工制品的方法。该研究通过对GenBank数据库收录的铁皮石斛及其同属近缘物种的ITS序列进行对比分析，根据变异位点设计双阻滞位点特异性鉴别引物，并优化PCR条件，对铁皮石斛及其69种近缘种共362个样品进行扩增和检测。结果显示，在退火温度为60 ℃的同一PCR反应中，铁皮石斛均扩增出397 bp条带，而其他69种近缘物种均无条带，且该方法灵敏度高，检出限可达0.03 mg·L^-1。该文所建立的位点特异性PCR方法可实现铁皮石斛的准确鉴别，具有操作简便、稳定可靠、应用范围广的优点。

[关键词] 铁皮石斛； 位点特异性PCR； 分子鉴定

[Abstract] Based on rDNA ITS sequences of Dendrobium officinale and the other 69 species of Dendrobium， a pair of dismatched allele-specific diagnostic primers， TPSH-AS1F and TPSH-AS1R were designed to authenticate D. officinale from the other species. Thebidirectional PCR amplification were performed using the diagnostic primers with the total DNAs of the original plants or processing products as a template. When the annealing temperature was raised to 60 ℃， only the template DNA of D. officinale could be amplified whereas the diagnostic PCRs of the other Dendrobium species were all negative. Compared with the other authentification methods， the bidirectional PCR amplifications is not only simpler and time-saving but practical and effective.

[Key words] Dendrobium officinale； PCR amplificationof specificalleles； molecularidentification

近20年來，分子鉴别技术尤其是特异性PCR鉴别已广泛用于食品和中药的真伪鉴别。作为特异性PCR的发展性技术，位点特异性PCR（allele-specific PCR）、扩增阻滞突变系统及其衍生方法利用引物末端不完全匹配形成的扩增阻滞差异，已能够对单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点差异进行分型从而实现近缘物种的鉴别^[1-3]。但位点特异性PCR鉴别在设计引物时需要选择适宜的GC含量且尽量不含有重复序列，PCR扩增时也需要严谨的反应条件，因退火温度、酶量、引物量、循环数、模板浓度、Taq酶种类均可影响SNP分型结果，导致该方法应用推广受限^[4]。

对一些难以进行基因分型的近缘物种，需要建立更加稳定的鉴别方法。铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是石斛属石斛组药用植物，同组有30余个近缘物种，其形态和化学成分相似，传统手段鉴别困难。核糖体ITS序列在部分石斛种间存在极其显著的差异，且在种内具有一定的遗传稳定性，多个石斛属物种均有各自特异性SNP位点，是石斛物种鉴别的有效DNA分子标记^[5-9]。但核糖体DNA多为高重复串联序列，且具有很高的GC含量，设计的位点特异性PCR引物需要非常严格的PCR反应条件^[10-12]。为解决这一问题，本文在完成亚洲大陆石斛属分子系统学研究的基础上，以铁皮石斛为研究材料，利用石斛属ITS区变异丰富的特点，通过2个SNP位点设计1对均在3′端倒数第2位引入错配碱基的双阻滞特异性引物，使得仅铁皮石斛出现阳性条带，而石斛属其余69种物种均无条带，为铁皮石斛与近缘物种的鉴别提供了分子依据。

1 材料

1.1 植物材料 选取来自不同产地的铁皮石斛168个单株和69种194个石斛属近缘物种的茎362个DNA样品进行位点特异性PCR研究。植物样品采自我国安徽、云南、广西、浙江、重庆、贵州、西藏、海南、台北等省市，以及尼泊尔、老挝、越南和泰国，分别由安徽中医药大学俞年军教授和中国科学院植物研究所金效华博士鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心，见表1。

1.2 仪器 Veriti^TM 96孔梯度PCR仪（Applied Biosystems公司）；GeneAmp 9700型PCR仪（Applied Biosystem公司）；TC-512梯度PCR仪（TECHNE公司）；5810R型高速冷冻离心机（Eppendorf公司）； DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）； SYNGENE凝胶成像系统（GENE公司） 。

1.3 试剂 rTaq DNA聚合酶、SpeedSTAR HS TaqDNA聚合酶、MightyAmp DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、DL 2 000 DNA Marker购自TaKaRa公司； 2× High-Fidelity Master Mix购自北京擎科新业生物技术有限公司。

2 方法

2.1 SNP位點的筛选和引物设计 利用BioEdit软件对GenBank数据库中石斛属植物的ITS序列进行同源对齐，校对后分析铁皮石斛与近缘石斛物种差异SNP位点，利用Primer Premier 5.0软件设计铁皮石斛双阻滞位点特异性鉴别引物TPSH-AS1F/TPSH-AS1R，序列及PCR扩增程序见表2。

2.2 基因组总DNA的提取和PCR扩增条件的确定 取100 mg干燥样品，研磨成细粉后，置于1.5 mL离心管中，加入65 ℃预热的CTAB沉淀液750 μL，充分震荡混匀，65 ℃温育40 min，低速离心5 min，弃去上清，剩下管内材料按改良CTAB法^[13]提取总DNA。取不同样品DNA，调整至浓度约30 mg·L^-1，用通用引物ITS1和ITS4进行PCR反应以检测模板DNA质量。PCR反应体系为2.5 μL 10×PCR Buffer，1 μL 10 mmol·L-1 dNTPs，上下游引物各0.2 μL，0.5 U rTaq酶（5 U·μL^-1），1 μL DNA模板。反应在Veriti^TM 96孔梯度PCR仪上进行，反应程序见表2。反应结束后在PCR反应体系内加入5 μL 6×loading buffer，混匀后于EB染色的1%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察成像。

利用引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R进行位点特异性PCR反应，并分别考察退火温度、PCR循环数、Taq酶种类、不同PCR仪对铁皮石斛鉴别结果的影响，以确定最优反应体系和条件。

2.3 铁皮石斛位点特异性PCR鉴别 取来自安徽、云南、广西、浙江等地362个石斛样品，提取DNA并进行双阻滞位点特异性PCR扩增以检测方法的准确性和适用性。PCR反应体系为2.5 μL 10×PCR Buffer，1 μL 10 mmol·L^-1dNTPs，引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R（10 μmol· L^-1）各0.25 μL，0.2 U rTaq酶，1 μLDNA模板和19.8 μL ddH₂O。反应在Veriti^TM 96孔梯度PCR仪上进行，反应程序见表2。

2.4 检出限调整 铁皮石斛与石斛属近缘物种的总DNA至300 mg·L^-1，并进行逐级稀释依次获得质量浓度为300，30，3，0.3，0.03 mg·L^-1的系列DNA。以所稀释的DNA为模板进行铁皮石斛双阻滞位点特异性PCR，以能扩出条带的最低浓度确定检出限。

2.5 随机双盲测试 按医学双盲测试的要求，即样品编号、实验操作与结果判定3个环节分由3人完成，随机取40批经过确证的样品，提取DNA并进行双阻滞位点特异性PCR扩增。

3 结果与分析

3.1 铁皮石斛双阻滞位点特异性PCR引物设计 对石斛属33个物种175条ITS序列分析表明，ITS序列60位和417位为铁皮石斛特有SNP位点，铁皮石斛60位为C，其他石斛为非C；铁皮石斛417位为A，其他石斛均非A。利用这2个SNP位点设计铁皮石斛双阻滞位点特异性PCR引物，使正向引物TPSH-AS1F 3′端与铁皮石斛60位完全匹配，并在3′端倒数第2位引入错配C，反向引物TPSH-AS1R 3′端与铁皮石斛417位完全匹配，并在3′端倒数第2位引入错配A以增强引物特异性。利用引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R进行位点特异性PCR时，铁皮石斛模板末端与正反向引物匹配，扩增出长397 bp的条带，而石斛属其他近缘物种因扩增阻滞使扩增速度大大降低，见图1。

3.2 条件优化 位点特异性PCR衍生出的方法会受到退火温度、循环数、Taq DNA聚合酶及不同升降温等条件的影响。由于铁皮石斛、霍山石斛和细茎石斛亲缘关系较近^[14]，且是市场上流通的主要品种，商品形态上较为相近，更易混淆、难于鉴别，故本文挑选铁皮石斛、霍山石斛及细茎石斛，对这4个因素进行了考察，发现退火温度和Taq DNA聚合酶对双阻滞位点特异性PCR具有较大影响，而PCR仪及PCR循环数影响小。结果表明退火温度在58～62 ℃时，仅铁皮石斛获得约400 bp的特异性条带，退火温度过低时铁皮石斛近缘物种也产生微弱条带，导致假阳性，见图2A；当循环数为27～36时，仅铁皮石斛出现特异性鉴别条带，而循环数超过36次时，铁皮石斛近缘物种也可观测到微弱扩增条带，见图2B；在所选择的6种DNA聚合酶中，仅rTaq聚合酶能实现铁皮石斛与石斛属近缘物种的鉴别，见图2C；对不同PCR仪进行考察，表明3种PCR仪均可用于铁皮石斛与石斛属近缘物种的鉴别，见图2D。

3.3 准确性测试 所建立的方法对铁皮石斛的专属性鉴别能力，使用引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R对铁皮石斛及其同属69个近缘物种进行了双阻滞位点特异性PCR，仅铁皮石斛出现397 bp的鉴别条带，近缘物种均无条带（部分鉴定结果见图3A），说明双阻滞位点特异性PCR能专一性鉴别铁皮石斛。对铁皮石斛主产区安徽、云南、浙江、广西的362个样品和来自亳州的22批铁皮石斛枫斗进行鉴别也均可得到相同结果，见图3B，说明该方法具有良好的适用性。

3.4 检出限测试 优化后的PCR反应条件，对不同浓度的模板DNA进行特异性PCR。DNA模板质量浓度在30～0.03 mg·L^-1时，只有铁皮石斛能扩增出397 bp的特异性鉴别条带，且条带亮度随DNA模板浓度降低而减弱，模板DNA检出限达0.03 mg·L^-1，见图4。

3.5 隨机双盲测试 为检测方法的可靠性，随机取40批经过确证的样品，按医学双盲测试的要求运用本方法进行检测，鉴别结果与正伪品信息一致，见图5。

4 讨论

石斛属Dendrobium Sw.植物全世界约有1 000种，我国有74种2变种，而本研究选取了来自不同产地的铁皮石斛168个和69种194个石斛属的近缘物种共362个样品进行位点特异性PCR研究，几乎囊括了亚洲大陆石斛属全部物种，且铁皮石斛样品量大，采样地点多，具有一定代表性，对保障方法准确性具有重要意义。

位点特异性PCR具有操作简便、实验周期短的优点，理论上可对任意SNP位点进行分型，已被广泛应用于药材的真伪鉴定和鉴别研究^{[1-3，10-12，15-16]}。位点特异性PCR对反应条件较为严格，退火温度、循环次数、Taq酶种类及PCR仪均可能影响鉴定结果，即当更换其中某一条件时，需重新调校其他条件，故在实验操作方面，引物的筛选和实验条件的优化尤为重要。目前已报道的利用位点特异性PCR对石斛属植物鉴定方法多对复性温度、DNA模板浓度及纯度要求较高^[10-12]，容易导致方法重现性较低，应用受限。本文研究结果表明，退火温度、PCR循环数和PCR仪对本方法鉴别结果均影响不大；PrimeSTAR HS DNA聚合酶与SpeedSTAR HS TaqDNA聚合酶、MightyAmp DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶及2×High-Fidelity Master Mix均为高保真酶，具有3′-5′外切酶活性，对DNA合成时的错配碱基存在“识别—逸漏—反复识别”的过程^[17]，反应中DNA模板浓度、添加酶量及退火温度均影响酶的聚合能力；采用的Taq酶无3′-5′外切酶活性，可造成混淆品因延伸反应扩增受阻而致反应速度大大降低；在方法建立中使用了双盲测试，更进一步验证了所建立方法特异性好、重复性高、稳定可靠。

本研究根据铁皮石斛与石斛属近缘物种的ITS序列设计了3对特异性引物，发现引入错配碱基的个数和位置对特异性引物扩增效果和鉴别特异性影响均较大。Kwok等^[18]研究表明，在引物3′端倒数第2，3个碱基的位置引入错配对提高引物特异性的效果最好，且G/T错配扩增相对容易。本实验中在上下游引物3′端前一位均人为引入错配，且所有错配均为嘌呤-嘧啶替换模式，这种替换模式可有效阻滞69种铁皮石斛近缘物种的非特异性扩增，而铁皮石斛特异性扩增效果依然较好。此外，本方法的检出限为模板DNA质量浓度在0.03～30 mg·L^-1，这可能与所使用的SNP位点位于具有高拷贝数的ITS序列上，故对降解程度较严重的石斛加工制品仍能有效鉴别，所以本方法对市场上铁皮石斛加工制品的真伪鉴别有重要参考价值，也对铁皮石斛加工制品的质量稳定性和安全性提供技术保障。

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[责任编辑 吕冬梅]