大通道毛细管电泳技术的研究进展

徐 然, 李优鑫, 贾菲菲, 王丹丹

(天津大学药物科学与技术学院，天津市现代药物传递及功能高效化重点实验室，天津化学化工协同创新中心，天津 300072)

1 引言

自上世纪80年代以来，毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)以其高效、快速、高灵敏度、生物兼容性好、运行费用低、样品和试剂消耗量少及自动化等优势，已成为当今实验室常用的分析手段之一，在化学[1 - 3]、生物[4 - 6]、制药[7 - 8]和临床[9 - 11]等领域中得到了广泛的应用。通常CE都是在25～100 μm内径的通道上展开的，随着CE在各个领域应用范围的不断深入，其窄内径所造成的劣势渐为突出，主要表现在样品的载样量低，痕量物质的检测灵敏度低，样品的半制备和制备困难等，这些都限制了CE的应用范围。与此同时，复杂物质的分析越来越依赖于日益盛行的多维分析技术以及联用技术，而CE的低载样量却给样品的转移及进一步检测带来困难。解决CE这些局限性的有效途径之一是增大分离通道的内径，但内径的增大会引起焦耳热的增加，使得缓冲液中易产生气泡，引起电流的波动，降低了分析效率，同时样品在由焦耳热引起的较高温度下易失去活性，降低了分析结果可靠性。为此，科学家们尝试了降低电场强度、使用低电导率缓冲液、加入有机试剂、引入制冷机制等多种解决焦耳热问题的方法，逐渐发展了大通道毛细管电泳(Wide-bore Electrophoresis,WBE)技术。WBE作为CE技术的一个崭新的发展方向，具有如下优点：(1)载样量高，检测灵敏度高，有利于痕量组分的分析。(2)具有半制备或制备样品的潜力。(3)易于建立多维分析模式，实现样品全面分析。(4)可与其他分析或鉴定技术进行联用，分析复杂样品。

本文结合本课题组前期在具有制冷技术的WBE[12 - 14]、二维WBE系统[14]、WBE与高效液相色谱联用系统[15]中的研究成果，评述了WBE技术、多维WBE技术以及WBE与其他方法联用技术等各类大通道毛细管方法，比较了WBE技术与其他常用分析技术的优缺点，并展望了WBE技术的发展趋势及应用。

2 大通道毛细管电泳技术及其多维和联用技术

2.1 大通道毛细管电泳(WBE)技术

2.1.1不具有制冷作用的WBE技术WBE技术作为有效的样品分离分析以及检测技术，可以在不制冷的作用下通过采用低电导率缓冲液、低电场强度、添加有机试剂以及采取电色谱模式等方法减少焦耳热的产生。Minarik等[16]在200 μm内径的聚乙烯醇涂覆毛细管上，通过使用低电导率的缓冲液进行N-糖基化组分的分离与收集，与150 μm毛细管相比，载样量增加了300倍。Rodriguez等[17]在低电场强度下用内径为100 μm或者200 μm毛细管检测细菌污染，在分离过程中未出现焦耳热问题。

在不具制冷作用的WBE中，电色谱是另一种容易开展的电泳模式。因为电色谱毛细管内填充了合适的填料，其有效体积减小，电流也随之降低，并且电色谱缓冲液一般含有较大比例有机溶剂，这可进一步减小电流降低焦耳热。1974年，Pretorius等[18]首次报道了1.0 mm内径的大管填充柱，但是未见任何分离结果。1994年，Yan等[19]探索了使用大内径柱的可能性，他们将3或5 μm的十八烷基键合硅胶(ODS)填充至320 μm内径毛细管柱内，使用低电导率的运行缓冲液，试图控制电渗流及焦耳热。1998年，Pusecker等[20]在400 bar的压力下，将5 μm ODS粒子和10%的3 μm硅胶粒子(丙酮溶液)悬浮液填充到了250 μm毛细管，该柱在低电压下产生的热量明显减少。Chen等[21]在550 μm内径的半制备毛细管上填充了1.5 μm的ODS粒子，在4 kV分离电压下，实现了500 nL 8.5 μg紫杉醇和9 μg浆果赤霉素的理想分离。Qu等[22]通过制作内径2.7 mm 到6.0 mm掺杂石英微粉的干凝胶整体柱，来减小孔隙率及柱子的电流，进而减少焦耳热的产生。在2.7 mm内径整体柱中，苯甲醛的理论塔板数高达52 000/m，检测限约为0.3 μg/mL。Hu等[23]在改进他们操作[24 - 26]的基础上，通过原位共缩合苯基三乙氧基硅烷(PTES)和正硅酸乙酯(TEOS)，在530 μm的毛细管内制作了苯基功能化的混合硅整体柱。该整体柱可以成功的从可乐样品中提取双酚A(BPA)，且检测限达1.8 ng/mL。

虽然以上方法有效减少了焦耳热，但这些方法都是减少焦耳热产生的手段，未考虑从根本上及时原地的带走电泳过程中产生的焦耳热，随着使用次数和使用时间的增加、管径的继续增大，大管内部会蓄积热量，电泳的分离分析仍受到不可忽视的影响。对于填充柱更存在制备重现性差，制备过程复杂，分析结果可重复性较差等问题。因此，新的控制焦耳热的方法仍在探索中。

2.1.2具有外制冷作用的WBE技术外制冷作用是通过在大管的外部采用一些方法，如液冷控温、风冷控温、固体接触控温等以加速传递焦耳热，从而及时除去焦耳热。Hjertien等[27]报道了将200 μm内径的玻璃管放入到温度20 ℃的水中进行主动冷却来迅速消散电泳过程中产生的焦耳热，在短时间内成功地分离了腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶，并获得了高的分辨率。自那之后，Yin等[28 - 29]报道了用强制空气冷却来控制毛细管的温度为25 ℃。结果表明：在25 ℃时，180 μm毛细管内的温度可与75 μm毛细管温度基本一致。同时，未见两者之间明显的谱带展宽，这表明控制温度后内径增大基本不会影响重组人生长激素的胰蛋白酶消化肽的分离。Riekkola等[30]通过将分离毛细管插入到一段塑料管内控制了毛细管的温度，即通过将一个盘绕的铜管浸入水中使空气冷却到22 ℃，通过将上述冷空气引入塑料管中消除焦耳热，即使使用530 μm内径的管道也可以使布美他尼和利尿酸得到很好的分离。在控制毛细管温度为25 ℃下，Oukacine等[31]应用等速电泳模式在内径为200 μm的大管中进行了高灵敏度革兰氏阴性菌的定量分析，在不添加任何荧光染料的情况下，检测限可达到3 000 cells/mL，该方法可以较容易的应用到水样中细菌的定量检测。Karger等[32]尝试了将内径为50～200 μm的毛细管与半导体致冷器件直接接触的方法消散产生的焦耳热，成功控制了毛细管的温度。

1998年，Riekkola等[30,33 - 34]采用非水介质代替含水缓冲液，同时通过外部水制冷不仅可以控制毛细管温度在20 ℃，还可以使自动进样器的温度低于20 ℃，可以减少样品和缓冲液的挥发。他们通过研究20 mmol/L 乙酸铵的乙醇-乙腈-乙酸(50∶49∶1，V/V)缓冲液这一非水介质对CE分离的影响，证实了有机溶剂比水溶液更适于半制备用途的WBE[33]。进一步研究[34]证明C1～C5的醇类可以添加到非水介质中使用。如：含20 mmol/L乙酸铵的正丁醇-乙腈-乙酸(50∶49∶1,V/V)溶液作为缓冲液可分离地匹哌酮、美沙酮、镇痛新、左啡诺和二氢可待因，当毛细管内径从50 μm增加到200 μm时，载样量增加了16倍，当毛细管内径从50 μm增加到320 μm时，载样量增加了41倍。虽然非水电泳缓冲液的离子强度很低，电流很小，所产生的焦耳热也小的多，并且由于其采用了外部制冷，进一步减少了焦耳热，使得采用更大孔径的毛细管成为可能，但实际中很多样品不适合非水环境下进行分析，限制了该技术的应用范围。

这种外部制冷的方式也被引入到大管电色谱中。Angus等[35]将1.5 μm反相无孔硅胶装入254 μm毛细管内制备了整体柱，并通过外部控温将整体柱恒温在25 ℃，从而实现了极性不带电药物高效快速的分离。采用外部制冷方式能在一定范围有效消散焦耳热，其中风冷制冷和液冷制冷已普遍应用。但该方式也有其局限性，如需添加外部设备，运行成本升高。

2.1.3具有内制冷作用的WBE技术随着WBE技术的发展，内制冷技术也引入到WBE技术中。例如，Liu等[36]提出了带有内制冷机制的WBE系统，即在大通道毛细管内插入一根通有制冷介质的毛细管，循环的制冷介质可以将电泳过程中产生的热量及时带走。该系统初步证明了具有内制冷机制的WBE可以有效地去除焦耳热，比传统的CE方法更能有效地耐受高电流。

2.1.4具有内外制冷作用的WBE技术在上述研究的基础上，一些研究者进行了具有内外制冷的WBE技术的研究。例如，我们课题组[14]在之前研究的基础上[12 - 13]进一步改进了WBE系统。即在内制冷毛细管的两端套用大小合适的中空纤维管(内径/外径：0.69/1.00 mm，长度：0.60 cm)，使其固定在大管内部轴向中心位置，从而避免了由于重力造成的偏离，并且外部控温以及内制冷毛细管的引入可及时带走产生的焦耳热。改进的WBE系统与之前随机固定内制冷毛细管的WBE相比，对6种有机酸包括对甲苯磺酸、邻碘苯甲酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和烟酸的分离得到了有效改善。

在毛细管电色谱(CEC)中常会出现堵塞和气泡的问题，所以整体柱的制作不易。我们课题组[37]同时研究了大管电色谱系统。在1.2 mm石英管内制作了聚丙烯酰胺整体柱，该大管电色谱系统同时具有内、外制冷。在只有外制冷的情况下，可观察到电流与电压之间的关系明显偏离欧姆定律。相反，当同时使用内外制冷时，在相同的条件下从0～625 V/cm具有良好的线性范围。该大管电色谱系统成功分离了三种中性化合物硫脲、萘、联苯和两种合成食品染料黄色5号和蓝色1号。其中对联苯的载样能力高达3 μg，这是普通CEC载样能力的几百倍。当进样1 μL样品后，蓝色1号的理论板数达到了55 000/m。本课题组[38]还报道了另一种具有内外制冷的大管电色谱系统，即在1.0 mm石英管内采用自制的氨丙基改性纳米颗粒作为运行缓冲液中的伪固定相，使6个芳香酸包括对甲苯磺酸、苯甲酸、苯乙酸、对氨基苯甲酸、扁桃酸和肉桂酸达到了完美分离并获得了高柱效，同时，载样量高达1 000 nL。

相比单纯外制冷的WBE而言，内制冷技术的引入可以从大管内部进行强行降温处理，这样一方面可以从焦耳热产生的源头将焦耳热及时有效的带走，另一方面还具有消除电泳分离通道中径向温度梯度的作用，载样量也由nL级提高到μL级(内径1 mm)。此外，该WBE系统可以较自由选择电泳条件，即该技术并不是抑制焦耳热的产生，而是加速焦耳热的消散，因此扩大了WBE技术的应用范围。

2.2 基于WBE的多维分离分析技术

随着生命科学的发展，需要分析的样品越来越复杂，一维的分离技术难以满足要求，急待开发出适用的高分辨分离技术。我们课题组[15]对一种结合CE的多维WBE系统进行了初步研究。该系统集分离、转移、反应、检测和储存于一体。在该多维系统中，转移毛细管和石英大管之间有足够的直径差，因此很容易在两种管之间建立零死体积接口。通过合理地控制转移电压，目标物可以顺利地转移至第二维进行进一步分离。该多维系统已成功分离、转移和二维分离了对甲苯磺酸、苯甲酸、肉桂酸三种带负电荷的有机酸、α-萘胺和对甲氧基苯胺两个带正电荷的有机碱和细胞色素C、溶菌酶和核糖核酸酶A三种带正电荷的蛋白质。此外，该多维WBE系统还成功在线和离线测定了碱性磷酸酶(ALP)的催化反应，该酶与阻塞性黄疸、肝癌和胆汁阻塞肝炎密切相关[39 - 40]并广泛存在于人体中[41 - 42]。

2.3 基于WBE的联用技术

2.3.1WBE技术与高效液相色谱(HPLC)的联用我们课题组[14]报道了将反相高效液相色谱(HPLC)和WBE系统进行串联所形成的正交联用系统(2D HPLC-WBE)，通过分离苯甲酸和苯乙酸对离线和在线模式进行了评价。在离线2D-HPLC-WBE分析中，两种酸经C18柱分析后收集的馏分可直接进行WBE分析而不需要任何浓缩、干燥和复溶过程。在线2D-HPLC-WBE分析中，色谱系统与电泳系统通过自制的具有400 nL体积定量环的六通阀进行直接连接，相比单一的HPLC或WBE分析，苯甲酸和苯乙酸在在线2D-HPLC-WBE系统中能得到更好的分离。

2.3.2WBE技术与核磁共振(NMR)的联用Pusecker等[20]报道了250 μm毛细管电色谱与NMR的在线联用。毛细管的一端插入进样装置，另一端通过聚四氟乙烯管与核磁共振探针相连。过量的苯甲酸烷基酯包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基苯甲酸酯通过电驱动进入毛细管，在20 kV电压和8 bar压力下用2 mmol/L硼酸盐的D2O/CD3CN(20∶80,V/V)进行分离后进入NMR仪，所有5种苯甲酸烷基酯通过化学位移值完成了鉴定。

2.3.3WBE技术与质谱(MS)的联用Varjo等[43]成功构建了一个液结型接口来联用非水型WBE与质谱(MS)。这个接口是将一个薄的喷雾毛细管插入大管内进行连接的。样品和缓冲液通过水浴冷却至25 ℃，毛细管通过空气制冷毛细管盒保持在相同的温度。脱氧麻黄碱、阿普洛尔和左啡诺作为模型化合物验证接口的可行性和稳定性。对于200 μm内径的大管塔板数可介于20 000/m和80 000/m之间，对于320 μm内径大管塔板数介于3 000/m～10 000/m之间，模型化合物的检测限达到35～265 μg/mL。虽然这个接口比较容易维护，但它制备繁琐，还需要进一步的发展以提高其可靠性。

Tomás等于2010年报道了WBE与MS的联用[44]，他们用一根短的毛细管将大管分离区与MS仪相连，短的毛细管作为输送通道以及无鞘电喷雾接口的电喷雾电离(ESI)尖端。样品先在恒定电流300 μA下，在0.8 mm的预分离毛细管中进行预分离，然后通过在特定时刻切换电流，区域中的一部分组分被带入到第二个0.3 mm的毛细管中进行进一步分离，分离后的等速电泳(ITP)区域通过喷雾液被在线转移到MS仪。该仪器进行了全血中维生素的分析以及胰蛋白酶消化肽的分离测定，具有高载样量和快速洗脱的优点。

联用技术的发展为复杂样品的分析分离带来了希望，通过将多个不同机制的技术进行结合，可以使复杂样品中不同性质的组分得到高效、快速、高分辨率的分离及分析。但接口问题是联用技术中的关键，还有待于进一步的研究。

3 大通道毛细管电泳技术与其他技术的比较

3.1 与CE的比较

WBE与CE相比最显著优点是WBE不仅是一种分析技术，而且通过采用大内径石英管在与CE相似分离效率的基础上明显增大了载样量，大大提高了检测灵敏度。此外，WBE系统具有较大的分析范围，从小分子物质如酸、碱、中性物质到大分子物质如氨基酸、蛋白质、核酸、甚至细胞等。并且，WBE系统可以将进样、分离、检测、转移、进一步第二维分离、检测于一体，是一种高通量和高性能的方法。

3.2 与平板凝胶电泳的比较

平板凝胶电泳具有平行操作和直接对比样品的优点[45]，还可以防止系统中对流运动，有助于提高分离效率，大多数生化实验室可满足其样品量需求[46]。然而，目前的平板凝胶电泳系统也有其局限性：凝胶具有散热问题，降低了效率并且限制了高电场强度的使用；凝胶具有相对强的紫外吸收，使得凝胶上的样品无法进行紫外检测；无法定量。对于平行分离多个样品而言，WBE可与平板凝胶电泳相抗衡。然而，WBE能更方便提供样品的定量信息[36]，电泳图上峰的详细信息，如峰面积、峰高可以很容易地获得作为定量依据。与平板凝胶电泳相比，WBE的分离效率更高，分析范围更广，定量更方便。

3.3 与HPLC的比较

HPLC是一种应用广泛、高效、快速的分析方法，根据色谱柱类型和样品性质的不同它包括多个分离机制。然而，其在手性化合物、多肽、核酸和蛋白质的分析中还有很大的发展空间。而WBE在上述样品的分析中具有很大的潜力，可作为HPLC分析的一种有效替代方法。与HPLC相比，具有多种分离模式的WBE是一种简单、快速和低成本的方法。此外，样品制备和预富集不是必要的，因为杂质可以很容易地在电泳中分离[47]。

4 总结与展望

CE作为当前分离效率最高的一维分离技术，在诸多领域得到了人们广泛的接受和认可。但CE样品用量少的特点已成为拓展其应用的技术瓶颈，使CE仅限于分析水平，很难实现复杂样品的进一步研究。WBE的出现解决了载样量低的问题，但随之出现的焦耳热的问题成为限制WBE发展的关键。研究者解决焦耳热问题的方法不外乎两种，一种是减少焦耳热的产生，如降低电压、加入有机溶剂、使用低电导率缓冲液以及采用电色谱模式等；另一种是加速焦耳热的传递，如引入制冷作用等。这些方法在一定程度上发挥了作用，但也有各自的局限。通过在大管内部引入内制冷毛细管是一种较为通用的，从根本上解决焦耳热的方法，值得继续研究与发展。多维WBE技术以及WBE联用技术提供了多功能整合的平台并且有利于对复杂样品进行进一步分析与研究，有很好的发展前景。

虽然研究者们为WBE的发展做出了许多努力也取得了很大进步。但也有很多任务需要解决。首先，WBE的应用在未来应扩展到更多的领域。由于扩大了管道内径，可以分析尺寸较大的物质而不会造成堵塞，如肿瘤细胞等。其次，多维WBE技术需要进一步改进，以获得更好的分离度和效率，通过转移多个平行样品并进行收集以达到半制备或制备目的。此外，基于WBE和其他分离鉴定技术的联用技术需要改进以获得复杂样品的详细信息。可以预料建立多功能集成的WBE系统或大管微流控芯片系统将是未来的发展方向，以将快速分离、分析、在线反应等一系列操作进行整合并实现于单次的运行中。