肝卵圆细胞的起源、标志物、调控和应用前景

王正洋(综述) 李晓波 殷莲华(审校)

(复旦大学基础医学院生理与病理生理学系 上海 200032)

肝卵圆细胞的起源、标志物、调控和应用前景

王正洋(综述) 李晓波 殷莲华△(审校)

(复旦大学基础医学院生理与病理生理学系 上海 200032)

肝脏在机体内发挥着重要作用,包括糖和脂质代谢,血浆蛋白的合成和对内外源性毒物的解毒作用等。目前肝脏的慢性疾病是导致人类死亡的重要原因。肝脏依靠肝细胞的自我更新和肝卵圆细胞的增殖分化两大途径参与肝损伤的修复。然而,我们对肝卵圆细胞的起源、特异性标志物、信号通路的调控等方面依然尚未完全阐明。最近一些研究通过运用新的分离技术和基因系谱追踪技术对肝卵圆细胞的起源和生物学功能有新的发现。本文较详尽地对以上内容进行了综述。

肝卵圆细胞; 肝损伤; 标志物; 信号通路

哺乳动物的肝组织具有强大的损伤后再生能力,主要通过两大途径:其一通过肝细胞的增殖进行肝再生,如急性肝损伤和正常肝脏的部分切除[1];其二当肝细胞增殖受到抑制时,通过胆管反应(ductular reactions)及其伴随的肝卵圆细胞(oval cells)增殖和分化进行肝再生,如慢性肝损伤和肝肿瘤[2]。肝卵圆细胞又被称为反应性胆管细胞(reactive ductal cells),是一种具有卵圆形的细胞核、直径大约10 μm、高核质比增殖能力很强的肝前体细胞[3],可分化为肝胆管上皮细胞和肝细胞,因此被普遍认为是肝脏的干细胞[4]。肝卵圆细胞激活且大量增殖后可向肝实质内迁移,破坏正常肝组织结构,甚至可导致肝硬化的发生[5]。其迁移、动员和归巢受到多种信号分子的调控,包括多种细胞黏附分子、细胞因子和趋化性分子[6]。深入研究肝卵圆细胞的来源、标志物和调控其增殖与分化的信号通路对肝卵圆细胞的临床应用非常重要。然而目前学术界对肝卵圆细胞的上述生物学特性仍然尚未完全阐明,这严重制约了肝卵圆细胞的应用前景。本文对肝卵圆细胞的起源、标志物、调控和应用前景进行综述,有助于该细胞的理论研究和未来的临床应用。

肝卵圆细胞来源 虽然目前对肝卵圆细胞的存在已经形成共识,但对其起源尚存在争议,以下3种来源方式得到较为广泛的研究。

来源于骨髓 1999年Petersen等[7]将雄性小鼠的骨髓移植到雌性小鼠体内后,雌性小鼠肝脏中约有0.14%的肝细胞带有Y染色体。此外,该研究人员还通过免疫磁珠分选中毒性肝损伤过程中大量增殖的肝卵圆细胞,不仅表达肝组织表面标志物如A6、AFP,也可以表达造血系统相关抗原,如CD34、CD45、Sca-1和Thy-1[8]。2007年Piscaglia等[9]的研究证实,粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF)可以通过促进骨髓来源的前体细胞迁移至肝脏从而参与肝组织的修复过程,并且G-CSF能够促进肝卵圆细胞的激活和增殖。以上研究结果提示,肝卵圆细胞可能来源于骨髓。然而,Wang等[10]发现骨髓来源的细胞主要是通过细胞融合过程参与肝修复过程,而非分化为肝卵圆细胞。Rountree等[11]将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的骨髓细胞移植入免疫缺陷的小鼠体内,通过免疫荧光、细胞流式和qRT-PCR实验发现在中毒性肝损伤过程中,骨髓来源的细胞可迁移至肝脏,但并未分化为肝细胞、胆管细胞和肝卵圆细胞,也并未表达肝组织相关的抗原。可见,虽然骨髓来源的细胞在肝损伤的修复过程中发挥重要作用,但并未通过未分化为肝卵圆细胞发挥作用。

来源于肝星状细胞 肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是一种可分泌细胞外基质的肝脏细胞,具有重要的生物学功能。其静息态时储存有大量的类维生素A,存在于肝窦内皮细胞(sinusoidal endothelial cells)和肝细胞之间的Disse间隙内,Disse间隙具有干细胞小体(stem cell niches)的特点,激活后可分化为肌成纤维细胞,进而导致肝纤维化的发生[12]。目前有研究发现它具有间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的特征,体外培养过程中某一时段其基因表达谱与肝卵圆细胞相似,可分化为成熟肝细胞[13]。利用Gfap(glial fibrillary acidic protein )和Acta2启动子构建的原基分布图(fate-mapping)实验显示,激活后的肝星状细胞可表达肝卵圆细胞相关抗原,而且可进一步分化为肝细胞[14]。Kordes等[13]研究发现,将肝星状细胞移植到肝损伤的大鼠体内,可以分化为成熟的肝细胞和胆管上皮细胞,进一步研究发现肝星状细胞通过间质上皮转化(mesenchymal-to-epithelial transition,MET)过程分化为上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)阳性细胞,后者是肝卵圆细胞和胆管细胞的常见表面标志物。Tatematsu等[15]在2-乙酰氨基芴/大部肝切除模型中(常用的抑制肝细胞增殖,且可以促进肝卵圆细胞增殖的肝损伤模型),将雄性小鼠来源的GFP+的肝星状细胞移植到雌性小鼠体内,结果显示肝星状细胞可以分化为肝细胞和胆管细胞。以上结果说明肝星状细胞可能是肝卵圆细胞的来源。然而,Lua等[16]利用卵磷脂视黄醇酰基转移酶(lecithin retinol acyltransferase,LRAT)和MESP1(mesoderm posterior 1 homolog)家系追踪实验(lineage-tracing experiments)发现在肝损伤的小鼠肝组织中,肝星状细胞并不能分化为上皮细胞。因此,关于肝卵圆细胞是否来源于星状细胞,仍有待进一步阐明。

来源于胆管上皮细胞 Hering小管连接胆小管和胆管,由肝细胞和胆管细胞构成,正常肝脏Hering小管周围可发现少数孤立的小立方形细胞,肝损伤后其周围可发生胆管反应,并伴随肝卵圆细胞的增殖[17]。Furuyama等[18]利用Sry(sex determining region Y)-box9(Sox9)品系追踪模型,发现具有干细胞性质的Sox9阳性细胞在肝脏往往聚集于胆道周围,推测Hering小管可能是肝卵圆细胞的重要的起源位置。Rodrigo-Torres等[19]利用三苯氧胺(tamoxifen)诱导的Hnf1βCreER/R26RYfp/LacZ小鼠追踪Hnf1β+胆管细胞,结果显示肝卵圆细胞来源于Hnf1β+胆管细胞。在正常的肝组织中,Hnf1β+胆管细胞并不能分化为肝细胞,但在某些肝损伤过程中,Hnf1β+胆管细胞可以分化为肝细胞。Foxl1 (Forkhead box L1),Trop2(encoded by tumor-associated calcium signal transducer 2)和Lgr5(leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5)是最近被发现的能相对特异性地表达于肝卵圆细胞表面的标志物,而且Foxl1+和Trop2+细胞也表达EpCAM和CK19(keratin 19)蛋白,培养胆管细胞过程中可以表达Lgr5蛋白[20],这些结果说明至少有一部分的肝卵圆细胞来源于胆管细胞。

肝卵圆细胞的标志物 明确肝卵圆细胞的标志物对其功能研究和临床应用具有重要意义。然而,在肝疾病过程中,肝卵圆细胞往往处于动态的不同分化阶段,包括未分化的前体状态、增殖状态和分化终末状态[21]。这些参与典型胆管反应的肝卵圆细胞呈现显著的异质性,要精确区分这些细胞群体非常困难,这极大地阻碍了高特异性肝卵圆细胞标志物的寻找。目前的研究认为肝卵圆细胞可表达:(1) 胆管上皮细胞标志物,CK-7、CK-8、CK18、CK19、OV-6、GST π、connexin43和A6;(2)幼稚肝细胞标志物,AFP、GGT、PKM2;(3) 造血干细胞标志物,Thy-1、c-kit、CD34、Sca-1[21-24];(4) 神经上皮细胞标志物,嗜铬粒蛋白A、神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule,N-CAM)、甲状旁腺素相关蛋白[25]。一些相对特异的抗体,如OV6、A6和EpCAM已经被广泛用于确定分离肝卵圆细胞[26- 27]。肝卵圆细胞标志物有如下特点:(1)不仅表达于肝卵圆细胞,也可表达其他多种细胞类型;(2)几乎没有一种表面标志物可以用来高度特异性地分离肝卵圆细胞;(3)肝卵圆细胞处于动态过程中,常常处于不同的细胞形态且表达不同的表面标志物,因此高纯度地分离它们有很大困难;(4)肝卵圆细胞的基因组具有物种多态性,不同物种之间差异较大[28]。虽然存在以上诸多困难,但寻找表达相对恒定且特异的肝卵圆细胞标志物仍然具有其必要性,值得进一步深入研究,这会成为开启肝卵圆细胞为临床更好服务大门的钥匙。

肝卵圆细胞增殖与分化的信号通路调控 研究调控肝卵圆细胞的激活、增殖与分化是更好地理解肝卵圆细胞介导的肝损伤修复与再生医学的重要前提。目前认为,调控肝卵圆细胞的增殖和分化是多种信号分子共同参与的生物学过程。越来越多的证据表明,多种细胞因子和信号通路参与肝卵圆细胞的激活、增殖和分化。Yeol等[29]通过gp130Y757F小鼠和 Socs3-/ΔAlb小鼠研究发现,活化STAT3信号分子或者SOCS3基因的缺失可促进肝卵圆细胞的增殖,而高表达SOCS3则可以抑制肝卵圆细胞的增殖。Sánchez等[30]除了证实激活的STAT3基因主要作用在肝卵圆细胞的增殖阶段,还进一步揭示了在肝卵圆细胞的不同发育阶段信号分子对肝卵圆细胞的激活作用不同,如NF-κB的作用贯穿于肝卵圆细胞整个增殖分化阶段。Martínez-Palacián等[31]通过重组基因和化学信号追踪技术发现c-Met和表皮生长因子(epidermal growth factor receptor,EGFR)介导的信号通路可促进肝卵圆细胞的增殖和存活。Yang等[32]研究发现:(1) β-catenin及其靶基因高表达于增殖状态的肝卵圆细胞中;(2)在肝卵圆细胞增殖的过程中Wnt/β-catenin通路持续激活;(3)Wnt/β-catenin通路可以促进移植后的肝卵圆细胞克隆样生长。以上结果表明Wnt/β-catenin通路在肝卵圆细胞的激活和增殖过程中发挥重要作用。其他一些重要的生长因子,如白介素-6 (interleukin-6,IL-6)、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、干扰素-γ (interferon-γ,IFN-γ)、抑瘤素M (oncostatin M,OSM)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)等均参与了肝卵圆细胞的增殖分化过程[30-33]。

肝卵圆细胞的临床应用 目前对于终末期的肝疾病,肝移植是唯一行之有效的方法。但肝移植伴随着许多副作用,如慢性肾功能衰竭[34]、移植后淋巴增生失调症[35]和心血管并发症[36]等。与肝移植相比,肝卵圆细胞移植具有如下优势:(1)直接来源于患者,无免疫排斥;(2)取少量的肝卵圆细胞即可大量体外扩增,对患者创伤小;(3)具有双向分化潜能,可分化为成熟肝细胞;(4)细胞小,不易堵塞血管导致门静脉高压;(5)多种肝损伤均有肝卵圆细胞增殖,因此可以被用来治疗多种肝疾病[37]。然而移植肝卵圆细胞的效率偏低、肝功能的恢复不佳、移植后导致链接紊乱(disruption of gap junctions)和缺血性肝损伤(ischemic liver injury)[38]以及肝卵圆细胞的致瘤性[39]依然限制肝卵圆细胞的临床应用。因此,虽然利用肝卵圆细胞来治疗终末期肝疾病的前景光明且优势明显,但是在应用于临床之前还有大量的理论和技术难题需要阐明和改进。

结语 肝卵圆细胞的激活、增殖和分化与机体内环境密切相关,受到一系列信号分子的调控。但其起源、标志物和调控还尚未完全阐明。只有通过更多更深入的研究,肝卵圆细胞这一令人兴奋的细胞才能够更好地应用到临床及治疗终末期肝疾病。

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The origin,marker,regulation and therapeutic potential of hepatic oval cells

WANG Zheng-yang, LI Xiao-bo, YIN Lian-hua△

(DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

The liver plays an vital role in glucose and lipid metabolism,synthesis of plasma proteins,and detoxification of xenobiotics.Liver chronic disease is one of the leading causes of death in China.Liver mass can be restored by two mechanisms:division of hepatocytes and hepatic oval cells (HOCs) proliferation and differentiation.However,the origin,specific markers and signaling pathways of HOCs have not been fully elucidated.Recent researches in HOCs isolation methods and genetic lineage tracing have enabled investigators to study multiple aspects of HOCs origin and biology.We reviewed the previous researches in detail.

hepatic oval cell; liver injury; marker; signaling pathways

国家自然科学基金(81270497)

Q28,R446.1

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.02.015

2016-03-08;编辑:张秀峰)

△Corresponding author E-mail:lhyin@shmu.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81270497).