Gel-HA-M复合材料联合钛网固定修复兔股骨缺损效果观察

李明，李全利，方望，汤健

(1安徽医科大学第一附属医院，合肥230022；2安徽医科大学附属口腔医院；3安徽医科大学第二附属医院)

·基础研究·

Gel-HA-M复合材料联合钛网固定修复兔股骨缺损效果观察

李明1，李全利2，方望3，汤健1

(1安徽医科大学第一附属医院，合肥230022；2安徽医科大学附属口腔医院；3安徽医科大学第二附属医院)

目的探讨明胶-羟基磷灰石-米诺环素(Gel-HA-M)复合材料联合钛网固定对兔股骨缺损的修复作用。方法将30只雄性新西兰大白兔随机分为复合材料组、自体骨对照组及空白对照组，每组10只。三组均建立股骨缺损模型(缺损长度12～15 mm)，复合材料组植入Gel-HA-M复合材料联合钛网固定，自体骨对照组植入自体股骨联合钛网固定，空白对照组仅行钛网固定。三组分别于术后4、8、12周随机选取3、3、4只兔，处死后取出股骨行大体观察、X线检查，HE染色后观察组织病理情况。结果术后4周：复合材料组植入材料与周围骨组织界限稍模糊，X线检查显示钛网周围无明显骨痂形成，HE染色可见片状、条索状、网状软骨样基质形成；自体骨对照组可见自体骨与断端部分愈合，X线检查显示钛网周围无明显骨痂形成，HE染色可见大量网状编织骨形成；空白对照组有2只存在感染迹象，X线检查显示钛网周围无明显骨痂形成，HE染色未见连续性骨样基质形成。术后8周：复合材料组植入材料的硬度与周围骨组织接近，X线检查显示钛网周围骨痂逐渐增多，HE染色可见新生骨组织明显增多，形成网状致密的骨小梁组织；自体骨对照组骨缺损处基本愈合，X线检查显示钛网周围骨痂逐渐增多，HE染色可见新生骨组织进一步成熟，骨组织钙化较之前增强；空白对照组未形成骨性愈合，X线检查显示钛网周围无明显骨痂形成，HE染色未见连续性骨样基质形成。术后12周：复合材料组骨缺损区已达到骨性愈合，X线检查显示钛网周围大量骨痂形成、两断端连接，HE染色可见新生骨组织逐渐成熟，伴髓腔形成；自体骨对照组骨缺损区基本达到骨性愈合，X线检查显示钛网周围大量骨痂形成、两断端连接，HE染色可见编织样骨组织趋于有序性排列；空白对照组断端仍未形成骨性连接，X线检查显示钛网周围少量骨痂形成，HE染色未见连续性骨样基质形成，伴有纤维结缔组织及炎性细胞大量增生。结论Gel-HA-M复合材料联合钛网固定对兔股骨缺损的修复效果与自体骨的修复效果相当，并有助于减少感染发生，是一种效果较好的人工合成骨缺损修复材料。

骨缺损；股骨；明胶；羟基磷灰石；米诺环素；钛网；兔

近年来因创伤骨折、感染和骨肿瘤等引起的骨缺损患者日益增多，而较大的骨缺损常常无法自我修复[1]。临床上常用自体骨移植或者用同种异体骨和动物源性的异种骨移植来修复骨缺损，但自体骨移植取材量有限且存在二次伤害[2,3]，同种异体骨和动物源性的异种骨移植有传播疾病和免疫排斥的风险[4]，因此人工合成骨缺损修复材料逐渐成为研究热点。羟基磷灰石与人体骨骼成分及结构相似，可被体内的细胞及大分子识别，具有较高的生物活性、骨传导性和生物相容性[5]。明胶是胶原的降解产物，具有低抗原性、无毒性、溶于水等优点，可被机体吸收并刺激移植组织产生新的胶原，广泛应用于人造皮肤、骨移植物等人工组织学领域，具有促进细胞黏附、增殖和分化的特性[6]。2013年1月～2016年11月，本研究采用新型纳米复合材料明胶-羟基磷灰石-米诺环素(Gel-HA-M)联合钛网固定修复兔股骨缺损，取得了较好效果。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：健康新西兰大白兔30只，体质量(3.0±0.3)kg，均为雄性，购自安徽医科大学实验动物中心。Gel-HA-M原料：CaCl2·2H2O、NaF、明胶、Na2HPO4·12H2O购于美国Sigma公司，盐酸米诺环素(纯度99%)购于武汉远程科技发展有限公司。钛网：为宝鸡钛金属公司生产的医用纯钛金属，采用纯钛材料制成0.8 cm厚钛板，冲压制孔，直径1.2 mm、孔间距0.6 mm。

1.2 Gel-HA-M复合材料合成 溶液A：将12.191 g CaCl2·2H2O溶于250 mL蒸馏水中。溶液B：将17.9 g Na2HPO4·12H2O溶于250 mL蒸馏水中，取8.365 g明胶在37～40 ℃条件下溶于其中，加入0.7g NaF，待其完全溶解后，用1 mol/L氢氧化钠或盐酸调节溶液pH值，使反应体系的pH值维持在10～11。溶液C：将0.334 67 g盐酸米诺环素溶于50 mL蒸馏水。通过仿生合成原理，将溶液A缓慢滴入溶液B，参照上法调节溶液pH值，整个反应过程在水浴锅中(保持温度为40～44 ℃)、有磁力搅拌的条件下进行。待二者完全相溶后，将pH值调至7，再缓慢滴入溶液C，反应体系搅拌3 h后，40 ℃恒温下静置过夜。收集产品，离心，去离子水搅拌洗涤后离心3遍，冷冻干燥，即可得到淡黄色的Gel-HA-M，说明米诺环素已经融入复合材料中。将材料压缩制备成颗粒状，钴60照射消毒1 h后备用。取少量粉末于4 mL EP管中，加入99%乙醇，在超声波中分散半小时，喷金后于SEM扫描电镜下观察材料形态。结果显示，Gel-HA-M复合材料的形态主要为长梭形，长度约200 nm，宽度约57 nm。

1.3 骨缺损模型建立及分组处理 将30只大白兔按照随机数字表法分为复合材料组、自体骨对照组及空白对照组，每组10只。三组均耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠溶液1 mL/kg进行全身麻醉，麻醉起效后取侧卧位，兔右后肢备皮，常规消毒铺巾。于兔右股部中段外侧纵行切开3～4 cm，循股四头肌外侧与股后肌群间隙进入，钝性分离肌组织和周围软组织，暴露股骨骨干，不进行骨膜下剥离。于股骨中段用电锯造成12～15 mm(为兔股骨干直径1.5倍左右)的缺损，即建立兔股骨缺损模型。复合材料组将1.2中合成的Gel-HA-M复合材料植入股骨缺损处，将钛网裁剪塑型成管状，固定在缺损股骨的近、远端并包绕Gel-HA-M复合材料；自体骨对照组将锯下的股骨用生理盐水冲洗，然后重新植入股骨缺损处，钛网固定缺损股骨两端并包绕自体股骨；空白对照组不植入任何材料，只采用钛网固定缺损股骨两端。三组关闭切口后均未注射抗生素。

1.4 骨缺损愈合情况观察 ①大体情况：三组分别于术后4、8、12周随机选择3、3、4只兔，耳缘静脉注射空气进行处死。取出右下肢，去除软组织，肉眼观察植入材料与骨缺损界面的生长情况。②X线检查情况：各组大体情况观察完成后进行右下肢X线检查，观察钛网固定及钛网周围骨痂形成情况。③组织病理情况：各组X线检查完成后，取部分骨缺损组织，甲醛固定，甲酸脱钙，石蜡包埋，3 μm厚度切片，常规HE染色，100倍显微镜下观察组织病理变化。

2 结果

2.1 各组大体情况比较 术后4周：复合材料组手术切口基本愈合，无感染迹象，植入材料颜色变淡，与周围骨组织界限模糊，其硬度明显增加，与周围骨组织硬度接近；自体骨对照组可见自体骨与断端部分愈合；空白对照组有2只存在感染迹象，骨缺损区可见脓性积液，骨折端吸收，随后补充2只纳入空白对照组。术后8周：复合材料组钛网周围有大量骨痂生成，植入物材料的硬度与周围骨组织接近，无炎症反应；自体骨对照组可见骨缺损处基本愈合；空白对照组未形成骨性愈合，部分软组织增生嵌入，两断端可见部分骨吸收。术后12周：复合材料组钛网周围骨痂进一步增多，与钛网和股骨干形成一个整体，用咬骨钳去除钛网后，可见骨缺损区已达到骨性愈合。自体骨对照组可见骨缺损区骨折线模糊，基本达到骨性愈合。空白对照组骨缺损处有少量骨痂形成，但断端仍未形成骨性连接。

2.2 各组X线检查结果比较 三组术后4、8、12周股骨复位均满意，股骨干力线对位良好，均无明显侧方移位、成角、分离等畸形，钛网无明显移位或松动迹象。三组术后4周均无明显骨痂形成；复合材料组、自体骨对照组术后8、12周钛网周围骨痂逐渐增多，术后12周钛网周围大量骨痂形成，大部分区域有连续性骨痴生成，两断端连接，并包裹钛网；而空白对照组术后8周钛网周围无明显骨痂形成，术后12周钛网周围仅少量骨痂形成。

2.3 各组组织病理情况比较 术后4周：复合材料组可见片状、条索状、网状软骨样基质形成，软骨周围可见原始骨小梁组织，新生骨基质周围可见大量软骨细胞和成骨细胞，软骨内成骨反应活跃；自体骨对照组可见大量网状编织骨形成，骨细胞散在分布在骨组织中。术后8周：复合材料组可见新生骨组织明显增多，形成网状致密的骨小梁组织，并可见成骨细胞排列在骨小梁周围；自体骨对照组可见新生骨组织进一步成熟，骨组织钙化较之前增强。术后12周：复合材料组可见软骨样基质明显减少，新生骨组织逐渐成熟，形成板层骨并排列有序，可见髓腔形成。自体骨对照组可见编织样骨组织趋于有序性排列及骨小梁应力性改变。空白对照组术后4、8、12周均未见连续性骨样基质形成，伴有纤维结缔组织及炎性细胞大量增生。

3 讨论

骨缺损的修复是组织工程学的一部分，为了使骨折断端重新形成骨性连接，需要在骨缺损处建立良好的修复条件，如手术去除断端内的骨折碎片、解剖复位后稳定骨折端以及骨修复材料填充骨缺损区域以避免骨不连修复等[7,8]。由于天然骨组织主要是以明胶作为有机物和羟基磷灰石作为矿物质而构成的，因此研究较多的是羟基磷灰石和明胶的复合物[9,10]。

目前，人工合成骨缺损修复材料在抗感染方面仍存在一些问题，如材料本身及其降解产物引起的炎症反应、细菌感染、长期静脉应用抗生素导致的耐药、体内药物毒性积累等。如能将抗生素溶入骨修复材料中，可使材料在发挥骨修复作用的同时，缓慢释放广谱抗生素，在骨缺损处形成一个局部抗菌环境，既能减少炎症反应和细菌感染的发生，又能避免长期全身应用抗生素带来的毒副作用。作为广谱抗生素，米诺环素对G+、G-及厌氧菌均具有较强的抑制作用，对骨组织亲和力强，且近年来研究发现米诺环素对成骨细胞也有一定的作用[11]。临床研究表明，人体可在不高于200 mg/d的剂量下安全耐受米诺环素[12]，体外实验也证实复合物中加入米诺环素可通过缓释作用发挥抑菌效果[13]。本研究合成的Gel-HA-M复合材料长度约为200 nm、宽度约为57 nm，这种纳米结构能够增加材料的粗糙度、亲水性、蛋白吸附性和原始细胞黏附性，具有良好的生物相容性[14,15]；不但具有良好的促进骨再生和抗感染作用，且无需加入生长因子、骨形成蛋白等。

本研究结果显示，复合材料组未见感染，组织病理学观察亦未见炎症反应，术后各时间点复合材料组及自体骨对照组局部骨小梁形成情况、骨性愈合情况均明显优于空白对照组；说明Gel-HA-M复合材料联合钛网固定对兔股骨缺损的修复效果较好，并有助于减少感染发生，其效果与自体股骨移植联合钛网固定相当。Gel-HA-M复合材料有望成为一种更经济、有效的人工合成骨缺损修复材料。

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安徽省科技攻关计划项目(1301042096)。

汤健(E-mail： tangjiancm@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.009

R687.3

A

1002-266X(2017)32-0033-03

2016-12-19)