超声波辅助花粉介导转基因方法的研究进展

王长彪，杜建中，赵兴华，刘 江，郝曜山，张欢欢，韩 斌，孙 毅

（山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031）

超声波辅助花粉介导转基因方法的研究进展

王长彪，杜建中，赵兴华，刘 江，郝曜山，张欢欢，韩 斌，孙 毅

（山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031）

超声波辅助花粉介导植物转基因方法是拥有国内自主知识产权的植物转化手段，该方法在玉米、油菜、花生等作物上的转化研究均取得积极进展。为较详尽了解国内外应用该方法进行植物转化研究的现状，针对该方法与其他植物转化方法比较所体现出的优势以及存在的问题进行了总结，以期为相关研究者提供一些参考资料，并为该方法的进一步改进完善提供依据。

植物；花粉介导；超声波；转化方法；进展

植物基因工程的诞生是全球农业生产史上的又一次革命，它的发展为农业、农村和农民带来了巨大的经济效益和环境效益。作为一个系统工程的植物基因工程，包括诸多内容，就其转化方法而言，世界上通用的、应用范围也较广的植物转化方法目前有农杆菌介导法[1]、基因枪法[2]、花粉管通道法[3]，还有一些相对应用较少的方法如PEG介导法[4]、电穿孔法[5]等，以及上述方法的改良衍生转化体系，这些方法是植物基因工程领域的关键技术手段，为全球植物转基因研发和产业化作出了巨大贡献。笔者要讨论的是最近10多年新发展起来的一种有花植物转化方法，超声波辅助花粉介导植物转基因方法的构思和摸索起步于20世纪90年代，并于1999年第一次申请并获得国家发明专利[6]，后因专利时效问题，于2011年再次申请国家发明专利并被授权[7]。该发明方法以植物花粉作为受体，以质粒DNA或其他携带有调控目的基因转录启动子和终止子的DNA作为供体，采集的花粉于最佳等渗溶液（5%～50%的蔗糖溶液）中进行第1次超声波处理，使花粉处于感受态，并使花粉粒上可能存在的核酸酶失活，避免这种核酸酶对其后加入的外源DNA的降解或破坏；然后在等渗液中加入目的DNA片段，进行第2次超声波处理，通过超声波的辅助作用使目的基因进入到感受态花粉中（整个处理过程花粉溶液都处在低温冰浴内）；接着把处理好的花粉授到植物柱头上，并收获其种子；来年将收获的种子播种，在播前对萌发种子和幼苗进行2次筛选，得到抗性苗；然后对成苗株取样进行PCR扩增及Southern杂交检测，确定转化事件。该方法无需耗时冗长的组织培养过程，突破了物种及基因型依赖性。众多研究表明，该方法的使用不仅节省了人力物力，缩短了转基因育种年限，还提高了植物转化效率。关于超声波辅助花粉介导植物转基因方法的推广应用，山西省农业科学院生物技术研究中心自2009年起先后举办了6届全国性的技术培训会议，起到了很好的宣传推广效果，也引发研究者对该转化方法的广泛关注和应用。

1 超声波辅助花粉介导植物转基因方法的原理及其可行性验证

超声波是物质介质中的一种弹性机械波，既是一种波动形式，又是一种能量形式。这种能量形式在其达到一定剂量并在溶液或细胞内传播时，能引起溶液或细胞的功能和结构发生变化，即产生了超声生物效应。超声波处理花粉主要是利用了超声波的空化效应和机械效应。空化效应是在超声波处理时，溶液或花粉内液形成空泡，空泡的震动与其迅猛的闭合会产生出冲击波，正是这种冲击波，可使花粉萌发孔瞬间打开或花粉破裂；同时空化泡破裂时产生的数千度高温和数百万帕的高压，可使溶液中水分子电离，产生OH－离子和H+，由此所诱发的氧化还原反应可使花粉粒上一些酶类失活。超声波机械效应是指超声波在传播过程中引起介质质点发生的压力变化，这种变化能破坏细胞的结构。

超声波辅助花粉介导植物转基因方法的原理就是利用超声波的空化效应和机械效应所产生的强大冲击力对花粉结构引发的改变，使花粉萌发孔瞬间打开，并借助这种冲击力使外源基因拥有能够进入花粉细胞内的动力。

花粉是种子植物特有的结构，相当于一个小孢子和由它发育的前期雄配子体，携带有植物的全部遗传信息。花粉授粉到同种植物柱头上，完成授粉过程，孕育下一代植株的诞生，所以，花粉是有花植物遗传和变异的重要器官。花粉是有生命的，花粉生活力是指花粉具有存活、生长、萌发或发育的能力[8]，与花粉自身的遗传特性和外界因素有着极其密切的关系[9]。田间自然状态下，水稻花粉寿命只有10 min；玉米花粉仅为1 d；菊花花粉为1～2 d。即便都是新鲜花粉，不同物种花粉的生活力也不尽相同，据报道，在均为新鲜花粉前提下，僵麦草花粉的生活力为100%，节瓜花粉为90%[10]，杏花粉仅为80%[11]。

温度、储藏介质、超声波处理等因素对花粉生活力都有一定的影响，现叙述如下。

据报道，烟草花粉在-5℃可保存1 a，仍正常萌发[12]，苹果-15℃可保存9个月，萌发率95%[13]，玉米5～10℃，可保存5 d，正常萌发[14]，水稻12℃可保存24 h[15]。温度对不同物种花粉生活力的影响有明显差异。对于超低温的影响，1922年，KNOWLTON[16]研究表明，金鱼草花粉在-180℃储藏仍有活力；VISSER[17]的研究证明，番茄、西洋梨和杜鹃花的花粉在-196℃储藏，花粉活力没有明显改变；WANG等[18]研究认为，番茄花粉在4，-196℃可保存1～3 d，延长保存时间，花粉生活力会急剧下降。对于高温的影响，BARROW[19]发现，高温对棉花花粉生活力影响较大，43℃时所有花粉失去生活力；刘自刚[20]采用在不同温度下干燥处理桔梗花粉的方式，研究处理后不同储藏时间内花粉的生活力，结果表明，30℃下花粉培养1.5 h是最佳条件。干燥箱、日晒、自然放置等不同干燥方式和处理时长，桔梗花粉萌发率和花粉管长度均有所下降，其中，45℃烘干1.5 h处理的花粉结实率下降速度最慢，保存5 d还能授粉结实。

花粉储藏的介质，多以水、无机溶液和有机溶液作为研究对象。王霞等[21]在对玉米花粉做EMS诱变处理时发现，配制EMS溶液的介质不同，处理条件下玉米的结实率明显不同，离体花粉在5%的蔗糖溶液处理效果最好，但处理时长超过30 min后，结实率下降，蒸馏水处理花粉的结实率几乎为0，而使用石蜡油作为介质，处理10～30 min效果最佳，处理时间延长，结实率下降；吕仲贤等[22]发现，通过扩散和渗透，玉米花粉中的营养成分进入介质水中，且花粉泡水会对花粉壁造成伤害；曹敏建等[23]的研究证明，蔗糖浓度过高会造成原生质脱水，抑制花粉萌发；刘雪莲等[24]报道，花粉培养介质中加入一定质量浓度的硼酸，可促进紫丁香花粉的萌发和花粉管生长，但不能过量，过量的硼酸会使花粉生活力下降[25]；张立磊等[26]研究蔗糖，硼酸，CaCl2，MgSO4，ZnSO4这5个因素不同浓度对丰花月季花粉生活力的影响，结果表明，按对花粉萌发的影响从大到小依次为蔗糖＞硼酸＞ZnSO4＞CaCl2＞MgSO4，前三者在一定浓度下对花粉的萌发有较大的促进作用，蔗糖最佳浓度为100 g/L，但超过最佳浓度时会起抑制作用，在一定浓度范围内，ZnSO4浓度对花粉的萌发率影响是先降后升，MgSO4浓度变化对花粉活力无影响。钙离子对花粉生活力的影响也很大，过少或过多的钙都会限制花粉和花粉管的生长[27]。

岳新丽等[28]用超声波处理葡萄花粉，发现超声波处理各参数对葡萄花粉有极显著影响，超声波处理参数以功率100～120 W，处理时间4～5 s，间隙时间2～6 s，处理6次的组合为最佳处理方法，既能保证花粉完整率和萌发率稳定，又不破坏外源基因DNA片段，GUS活性组织定位检测结果表明，转化率为4‰。胡雪娇等[29]采用温差-超声波结合的方法对核桃花粉进行破壁处理，发现在料液比1∶15 g/mL、温差110℃、冷冻时间18 h、超声时间35 min、超声功率720 W时，核桃花粉破壁率为83.79%，可见超声波处理强度和时长对花粉生活力的影响有多大；崔贵梅等[30]研究发现，超声波处理对花粉的生活力和萌发率都有影响，超声波处理后，花粉生活力下降50%，萌发率下降更严重，因此，超声波辅助的花粉介导转化方法结实率较低，空穗率达60%左右，结实穗也仅有几粒种子，多者二三十粒，虽然结实率低，但本方法的实际转化率却最高达28%以上。

关于外源DNA导入花粉及导入外源DNA后花粉生活力的证据，这方面的尝试最初是花粉粒与外源DNA混合培养，HESOLP-HARRISON[31]发现，外源DNA能透过水合花粉的内壁；O'DRISCOLL等[32]认为，外源DNA可通过花粉管尖端的胞吞作用进入花粉内，但HESOLP-HARRISON等[33]和KRANZ等[34]却提出了相反的观点；甚至LANGRIDGE等[35]还指出，通过花粉途径进行谷物转化是很难的，他们甚至还证明了早期的一些研究成果大概有人为创造之嫌；不过类似研究并未种植，随后的研究者又试图用显微注射法、电激法、基因枪法、激光微束法等解决外源基因导入花粉粒问题，如KRANZ等[34]通过玉米花粉萌发孔注射质粒DNA获得成功，随后用电激法、基因枪法等也成功将外源DNA导入花粉粒，这些研究结果经分子杂交实验、GUS组织化学分析、电镜观察和共聚焦激光扫描显微镜观察等手段均得到证实；但是证明外源DNA能够进入花粉且能够保证花粉具有一定的生活力还不够，对这些携带外源基因的花粉的育性大小还需要详细探讨[36]；LEONNE等[37-38]将转化的花粉授粉于原品种柱头后发现可正常结实；2013年，李娜等[39]把绿色荧光蛋白基因GFP转入玉米离体花粉中，对转化花粉进行体外培养和人工授粉，用荧光显微镜观察GFP基因在花粉、花粉管以及胚中的表现，发现转化胚与非转化胚均有强烈荧光，认为以花粉粒荧光反应作为花粉转化依据不可靠；同时还发现，转化花粉人工授粉后，被授粉植株的花粉管和胚中均有GFP表达的荧光反应，认为后两者可作为花粉介导转化的证据，授粉植株的种子播种后得到转化植株及后代。李娜等再次以充分证据证明花粉介导转化方法可将外源DNA导入花粉中，并能获得转基因植株。

2 超声波辅助花粉介导植物转基因方法的研究进展

超声波辅助花粉介导植物转基因方法（简称花粉介导法）的最早研究报道见于1997年。1999年，王景雪等[40-41]研究表明，于1997年采用花粉介导法将几丁质酶基因导入玉米自交系太9101、综31等材料，获得转化植株，转化率高达42.9%，并认为本法简单、易操作、实用且省时；2002年，梁雪莲等[42-43]采用注射法、花粉介导法和萌动胚法转化bar基因导入玉米黄糯、白糯、金黄96C等中，均获得了转化植株，但3种转化方法结实率分别为1%，3%～4%，3%～4%，从转化目的性看，后两者也强于注射法，进一步分析发现，同种试验条件下，这3种方法的转化率高于基因枪法和农杆菌介导法，且不需组培和再生过程，省时省力；同一年，陈定虎[44]研究表明，采用花粉介导法将携带PAP基因的植物转化载体导入玉米材料中，获得了32粒种子，播种得到9株植株，经PCR检测得到5株有目的基因存在的植株，再经Southern，Western等杂交检测得到1个转化事件，对其后代的抗病鉴定发现，接种病毒后，非转化株系7 d后发病，而转化植株直到25 d时也未发病；解志红[45]采用花粉介导法将几丁质酶基因转化棉花远缘杂交高代材料海208、海209，转化率达到32%；2004年，王节之等[46]采用花粉介导法将几丁质酶基因导入谷子品种晋谷21号不育系，T1PCR检测获得7个阳性植株，T2株系先喷除草剂筛选，存活植株做抗病鉴定，结果显示，转基因谷子株系的黑穗病发病率明显低于非转化的对照株系，最终获得了双抗植株；杜春芳等[47-48]利用花粉介导法将GUS基因导入油菜晋油7号，GUS组织化学分析和活性检测均证明，GUS基因导入花粉粒且收获到授粉植株的种子，进一步检测获得6个转化植株；2006年，梁雪莲等[49]利用花粉介导法将抗虫基因CpTI导入花生品种仲恺01号，就蔗糖浓度、超声波处理等对花粉生活力的影响进行了研究，结果表明，对于花生的花粉，蔗糖浓度以10%最佳，超声波强度为100 W时，花粉无损伤，200 W时，细胞结构完整，但细胞壁受损，300 W时，花粉解体，同时染色观察结果还发现，超声波强度为200 W时，花粉仍具有生活力；2007年，WANG等[50]以花粉介导方法把带有GUS基因和NPTII基因的质粒DNA导入高粱雄性不育系A2V4A，经GUS活性分析等检测，证明获得了转基因材料；2008年，WANG等[51]将抗草甘膦基因aroA-M1用花粉介导法转入油菜品种杂71和杂74，经PCR，Southern等分子检测，证实获得了抗草甘膦除草剂的转基因植株；雷海英等[52]采用花粉介导法将玉米矮花叶病毒复制酶基因NIbT导入玉米自交系金黄96C，金黄96B，478，C649等材料中，获得了转化植株，田间接种病毒结果显示，非转化对照植株全部为病毒敏感或高敏感材料，而转基因植株多为抗病毒或高抗病毒感染的材料；杜建中等[53]以花粉介导法将水稻几丁质酶基因导入玉米自交系海92-1中，获得了5株转基因植株，对其后代株系进行抗病鉴定，结果发现，转基因株系植株的抗病性比非转化对照株系提高1～2级；2009年，魏玉杰等[54-55]以花粉介导法将萝卜抗菌肽基因和卡那霉素抗性标记基因转入野罂粟花粉并给野罂粟授粉，PCR初步检测得到4个PCR检测阳性植株，并发现110 g/L蔗糖浓度为野罂粟花粉最佳处理介质，蔗糖浓度与处理时间对处理花粉授粉后的结实率影响达显著水平，后代植株在田间进行卡那霉素涂抹试验，结果与PCR检测结果相同，最突出的是野罂粟处理花粉授粉后的结实率达到80%；2010年，任小燕等[56-57]采用花粉介导法把山菠菜胆碱单加氧酶（AhCMO）基因导入玉米自交系郑58中，对获得的转化植株的第2代进行耐盐性鉴定，发现在盐胁迫浓度为250 mmol/L时，转基因玉米植株的超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性及叶绿素含量分别比非转基因玉米提高2%～208%，22%～65%和8%～61%，而丙二醛（MDA）含量比非转基因玉米低3%～93%，生理指标测定结果证明，转化耐盐基因CMO赋予了转化植株的耐盐性，转化植株的耐盐性比对照提高1～3级；2011年，韩凯[58]采用花粉介导法将EPSPS基因和谷氨酰胺合成酶基因（GSI）导入玉米玉美头品种中，获得了转化植株，转化率为4.17%，高于基因枪法的转化率；王秀红等[59]利用花粉介导法以玉米自交系郑58、昌7-2和PH6WC为受体，把小麦耐低磷调控基因TaPHR1和GFP的融合蛋白基因TaPHR1∶∶GFP转入受体中，获得了转化植株，转化效果以郑58为最佳，收获种子发芽做GFP荧光观察，发现目的基因已经表达；张婷婷等[60]采用花粉介导法将抗逆性相关受体类蛋白基因（OsSIK1）转入玉米自交系材料98-2-19、郑58、昌7-2中，发现郑58和昌7-2更适合用作本方法的转化材料，收获种子播种后取样PCR检测，昌7-2的PCR阳性结果率高达74%以上，证明花粉介导法的高效性；林春晶等[61]利用花粉介导法（有改良）将玉米植酸酶基因phy转入玉米品种，经PCR和RT-PCR检测，证明得到转化植株，目的基因也得到转录表达；2012年，宋鉴达等[62]利用经过改良的超声波处理花粉方法将植酸酶基因phy和bar基因转化到玉米品种郑单958中，经分子检测，获得了转化阳性植株，转化受体中目的基因的表达和效能正在进一步研究；同年，郝曜山等[63]以玉米自交系昌7-2及郑58为受体，采用花粉介导法将双价抗虫基因BmkIT-Chitinase分别导入受体材料中。对获得的T0代1 563粒种子，进行卡那霉素初筛，并连续4代对转化植株后代株系进行分子检测，最终获得20个转化株系，抗病鉴定获得16个抗病株系，农艺性状的调查结果证明，转化方法对受体植株其他农艺性状没有太大影响；2013年，马倩倩等[64]以黄花梨花粉为载体，将绿色荧光蛋白基因GFP导入黄花梨植株，获得了转化植株，转化率为3%，通过对花粉等渗液、超声波强度等参数的分析，建立了黄花梨遗传转化体系。

3 超声波辅助花粉介导植物转基因方法的优缺点

花粉介导法能在植物转基因研发实践中被大量采用，就足显本方法的适用性。花粉介导法的优势为：（1）方法简单易操作，无需贵重精密仪器设备，如基因抢、组培间等，而且研发场地只要符合转基因安全条例规定即可，所以，操作起来相对简单；（2）适用范围广，只要是有花植物，理论上都可采用本方法进行遗传转化研究，不存在单子叶植物还是双子叶植物之分，解决了一些难以组培再生植物的转化难题；（3）节省时间和人力，不需要冗长的组织培养和再生过程，与农杆菌介导法、基因枪法比较，能省时、省力；（4）转化效率高，有资料显示，相对于其他转化方法（转化率多为3%～5%或稍高），大部分植物采用此法的转化效率都在15%以上；（5）便于常规育种专家的利用，因为方法简单易操作，常规育种专家也能现学现用，有利于植物转化方法的推广应用等。但花粉介导法也有其劣势的一面，如转化时期受植物生长季节的约束；对于花粉较少的或不易采取花粉的植物而言，此法有其局限性；如何提高处理花粉授粉后的结实率也是本方法需要攻关的难题等。

总之，花粉介导法的发明与推广应用业已产生了很好的效果。SUSAN[65]曾评论，发展非组培植物转化方法是所有生物技术学家的梦想，因为这种方法既能打破植物转化的基因型壁垒，又能廉价、快速地得到转化植物，所以，这种基因导入方法倍受期待。油菜、高粱等作物的成功是谷物花粉转化领域的一次革新。

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Research Progress of the Ultrasonic Assisted Pollen-mediated Transgene Method

WANGChangbiao，DUJianzhong，ZHAOXinghua，LIUJiang，HAOYaoshan，ZHANGHuanhuan，HANBin，SUNYi

（Research CenterofBiotechnology，ShanxiAcademy ofAgriculturalSciences，Taiyuan 030031，China）

Ultrasonic assisted pollen-mediated planttransgene method is a planttransformation means with domestic independent intellectualproperty rights.Ithas made some positive progress during using to transfer maize,rape,peanut plants and other crops.To understand status quo ofthis means used in planttransformation research athome and abroad in more detail,and its possible application prospect,to knowmore aboutthe application status and research progress ofthe method，this papermakes a briefsummary ofthe research on this method at home and abroad,hoping to provide some reference for the related researchers,and to provide the basis for future improving the method.

plant;pollen-mediated;ultrasonic wave;transformation method;progress

Q943.2

：A

：1002-2481（2017）09-1571-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.41

2017-07-31

山西省重点研发计划项目（201603D221025-2）；山西省农业科学院种业发展专项（2016ZYZX50）；山西省农业科学院重点攻关项目（YGG1624）；国家转基因生物新品种培育重大专项（2014ZX08003001-002-003，2016ZX08003001-002-003）

王长彪（1975-），男，山西祁县人，助理研究员，硕士，主要从事分子育种研究工作。孙 毅为通信作者。