3种陆地棉下胚轴对草甘膦抗性筛选的鉴定

何积明，吕尊富，江九华，李飞飞

（浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江临安311300）

3种陆地棉下胚轴对草甘膦抗性筛选的鉴定

何积明，吕尊富，江九华，李飞飞

（浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江临安311300）

为了建立以草甘膦为选择标记且具有高效筛选效率的棉花遗传转化体系，研究选取WC，R15和新陆早45号这3个具有成功再生体系陆地棉的下胚轴为试验材料，分别以选择压2.5，5，10，20，50，100 mg/L的草甘膦质量浓度梯度进行草甘膦敏感性试验。结果表明，WC，R15和新陆早45号的最适抗草甘膦质量浓度分别是5，20，10 mg/L。说明不同陆地棉品种下胚轴具有不同的草甘膦抗性，选择合适浓度的草甘膦是获取阳性转化体的关键之一，研究为提高以草甘膦为选择标记的棉花转基因试验的筛选效率提供了技术支持。

陆地棉；下胚轴；草甘膦；抗性筛选

棉花是重要的经济作物和纤维作物，其产量和品质容易因滋生杂草而受到严重影响。草甘膦（Glyphosate）作为一种广普性除草剂，它能够有效解决杂草给棉花生产造成的干扰，具有低毒、高效、无污染和杂草不易产生抗性等综合性能[1]，是目前世界上使用范围最广的除草剂[2]。研究表明，草甘膦可抑制Epsps蛋白的活性，通过阻断芳香族氨基酸的生成，进而阻断一些芳香族化合物的生物合成，蛋白质合成受阻，无法进行正常的氮代谢，最终导致植株死亡；但草甘膦在杀死杂草的同时也会将棉花植株杀死。因此，利用转基因技术，培育具有草甘膦抗性的新棉种成为一种有效手段[3]。草甘膦的抗性基因为Epsps[4]，在一定的草甘膦浓度下，Epsps不被草甘膦抑制而能正常合成芳香族氨基酸及相关蛋白，从而使植株正常生长，表现出草甘膦的抗性[5]。

目前，农杆菌介导法是棉花转基因常用的方法。该方法有2个关键点：一个是成功的再生体系，另一个是合适的选择压浓度。研究表明，棉花对草甘膦这种除草剂具有一定的耐受性，不同的棉花品种对草甘膦的抗性不同[6]。章郑专等[7]研究发现，YZ-1的胚性愈伤组织对草甘膦有较强的抗性，用10 mg/L的草甘膦进行筛选，转化率可达到62.5%。谢龙旭等[8]以中棉所35的下胚轴为受体，以10.1 mg/L的草甘膦为筛选剂，获得了65株转化有草甘膦抗性基因的转化体。赵福永等[9]以陆地棉栽培品种石远321的下胚轴为受体，以13.5 mg/L的草甘膦为筛选浓度，获得38株转化有aroAM12和Bts1m基因的转化体。由此可见，选择适合不同棉花品种的草甘膦敏感性试验浓度，对于成功转化十分关键。

本试验选取3种具有成功再生体系的陆地棉WC，R15和新陆早45号为材料，设计6个草甘膦浓度梯度，对其下胚轴进行抗性筛选的鉴定，找到用草甘膦作为选择标记的临界浓度，以提高草甘膦为选择标记的棉花遗传转化效率。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以陆地棉（WC，R15和新陆早45号）种子无菌苗的下胚轴为材料。所用培养基为无菌苗培养基（1/2 MS）和草甘膦抗性筛选的培养基（MS＋0.1 mg/L 2，4-D＋0.1 mg/L KT＋0.75 g/L氯化镁＋30 g/L葡萄糖＋2.0 g/L菲特胶＋草甘膦（质量浓度分别为2.5，5，10，20，50，100 mg/L）。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗的培养 取WC，R15和新陆早45号种子各30粒，分别放入培养瓶中。然后倒入75%的乙醇消毒30 s，弃去乙醇；倒入30%的双氧水，并置于100 r/min的摇床上消毒3 h；超净台上用加头孢的无菌水清洗种子3次，无菌水浸泡过夜。待种子露白，在无菌条件下，剥去种子种皮，接种于1/2 MS培养基上，置于25～27℃条件下培养5～7 d[10-11]。

1.2.2 3种下胚轴的草甘膦敏感性试验 将下胚轴切成5～7 mm的胚轴段，分别接种到含有不同质量浓度（2.5，5，10，20，50，100 mg/L）的草甘膦愈伤诱导培养基上，每个浓度接种3瓶，每瓶接种5段，3次重复，置于25℃的组培室内培养，20 d左右统计下胚轴的膨大数和出愈数。

1.3 数据处理

利用SPSS 22.0软件进行方差分析，并采用邓肯氏（Duncan）新复极差测验法，对3个品种陆地棉下胚轴在不同草甘膦浓度下的膨大率和出愈率进行差异性比较。

2 结果与分析

2.1 WC下胚轴对草甘膦的抗性筛选鉴定

从表1、图1可以看出，当草甘膦的质量浓度为2.5 mg/L时，大部分的胚轴段有明显的膨大并且长出愈伤组织，且膨大率和出愈率分别为80%和38.89%，表明选择效力很低；当草甘膦的质量浓度在10 mg/L及以上时，胚轴段不膨大并且无愈伤组织出现，表明选择压太大；而当草甘膦的质量浓度为5 mg/L时，下胚轴有膨大，膨大率约为36.67%，几乎没有愈伤组织长出，起到了一定的筛选效果。因此，选取5 mg/L草甘膦作为以WC的下胚轴为受体的筛选浓度。

表1 WC下胚轴在不同质量浓度草甘膦培养基上培养20 d后的膨大率和出愈率

2.2 R15下胚轴对草甘膦的抗性筛选鉴定

由表2、图2可知，草甘膦质量浓度为2.5 mg/L时，膨大率与出愈率与对照间无显著差异，基本没起到选择效果；当草甘膦浓度分别为5，10 mg/L时，膨大率和出愈率均显著下降，但最低仍分别达到65.56%和22.22%，选择效果不显著；当草甘膦质量浓度大于50 mg/L时，均不再出现膨大和愈伤组织，表明选择压过大；当草甘膦质量浓度在20 mg/L时，下胚轴少部分出现膨大和愈伤组织，膨大率和出愈率分别约为26.67%和11.11%，可以达到较好的选择效果。因此，选取20 mg/L草甘膦作为以R15的下胚轴为受体的筛选浓度。

表2 R15下胚轴在不同浓度草甘膦培养基上培养20 d后的膨大率和出愈率

2.3 新陆早45号下胚轴对草甘膦的抗性筛选鉴定

新陆早45号对草甘膦的敏感性结果如表3和图3所示。从表3、图3可以看出，草甘膦质量浓度为2.5 mg/L时，出愈率显著下降达到36.67%，而膨大率下降不明显，为90.00%；当草甘膦质量浓度为5 mg/L时，膨大率显著下降，但依旧较高，为50%，而此时出愈率为23.33%，所以这2个质量浓度的草甘膦选择压偏低，无法很好地将转化体和非转化体加以区分；当草甘膦浓度达到20 mg/L以上时，不再出现膨大和愈伤，选择压偏高；当草甘膦质量浓度为10 mg/L时，下胚轴有一部分膨大和少量愈伤组织，膨大率和愈伤率分别约为40%和11.11%，可以达到较好的选择效果。因此，选取10 mg/L草甘膦作为以新陆早45号的下胚轴为受体的筛选浓度。

表3 新陆早45号下胚轴在不同质量浓度草甘膦培养基上培养20 d后的膨大率和出愈率

3 结论

本试验设置了6个草甘膦的浓度梯度（2.5，5，10，20，50，100 mg/L）对3个品种的下胚轴分别进行抗性筛选鉴定，结果表明，WC，R15和新陆早45号的下胚轴对草甘膦的最适筛选质量浓度分别为5，20，10 mg/L。不同基因型棉花的下胚轴对草甘膦具有不同的抗性或耐受性，选择适合的筛选浓度是棉花转基因成功的关键点之一。

4 讨论

棉花再生体系的建立依赖于其基因型，国外成功转化的棉花品种主要是柯字棉系列，国内成功转化的棉花品种主要是冀字棉系列、中棉所系列及华中农业大学筛选出的高频体细胞胚胎发生品种“豫早1号”[12-13]。所以，本试验所选的3种陆地棉，都已成功构建了高效的再生体系，也是棉花转基因中的常用材料。

本试验结果显示，WC，R15和新陆早45号的下胚轴对草甘膦的敏感性质量浓度分为5，20，10 mg/L，由此可见，不同棉花品种对草甘膦的耐受性不同，因而，在进行以农杆菌介导为途径的遗传转化之前必须对草甘膦的使用浓度进行探讨。另外，棉花的组织培养和遗传转化是一个比较复杂和耗时的过程[14-16]。除感染和共培养外，其余环节都要通过草甘膦的筛选才可能获得高比率的转化植株，因而，在多个阶段进行草甘膦筛选，以淘汰那些未转化成功的个体十分必要。本试验通过研究WC，R15和新陆早45号3种陆地棉下胚轴对草甘膦的敏感性，初步确定了用于棉花遗传转化的下胚轴愈伤组织诱导和生长过程中草甘膦的适宜筛选浓度，为进一步棉花转基因试验奠定了基础。

［1］FRANZJE，MAOMK，SIKORSKIJ A.Glyphosate:a unique global herbicide[M].Washington：American Chemical Society Publications，1997：617-642.

［2］KNOWLES D A.Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations[M].Springer：DordrechtDOIPublisher，1998：41-79.

［3］马燕斌，王霞，吴霞，等.新的抗草甘膦转基因棉花获得的初报[J].山西农业科学，2013，41（10）：1046-1049.

［4］燕树锋，祝水金，刘海芳，等.转EPSPS基因抗草甘膦棉花的遗传分析[J].华北农学报，2015，30（3）：54-57.

［5］华水金，袁淑娜，邵明彦，等.抗草甘膦棉花研究进展[J].分子植物育种，2007，5（4）：534-539.

［6］李儒海，武怀恒，褚世海，等.转基因抗草甘膦棉花与常规棉花对草甘膦耐受性的比较研究[J].中国棉花，2010，37（12）：9-11.

［7］章郑专，汤磊鹏，王钰，等.抗草甘膦基因aroA转化陆地棉胚性愈伤组织的研究[J].棉花学报，2014，26（3）：237-243.

［8］谢龙旭，李云锋，徐培林.根癌农杆菌介导的转aroAM12基因棉花植株的草甘膦抗性[J].植物生理与分子生物学学报，2004，30（2）：173-178.

［9］赵福永，谢龙旭，田颖川，等.抗草甘膦基因aroAM12及抗虫基因Bts1m的转基因棉株[J].作物学报，2005，31（1）：108-113.

［10］吴慎杰，李飞飞，陈天子，等.利用农杆菌介导法转化泗棉3号的研究[J].作物学报，2007，33（4）：632-638.

［11］华水金，袁淑娜，邵明彦，等.抗草甘膦棉花研究进展[J].分子植物育种，2007，5（4）：534-539.

［12］刘方，张宝红.棉花组织培养高效植株再生体系的建立[J].棉花学报，2004，16（2）：117-122.

［13］谢德意.棉花体细胞胚胎发生能力比较及ipt基因的遗传转化[D].武汉：华中农业大学，2007.

［14］JINS X，ZHANGXL，LIANGS G，etal.Factors affection transformation efficiency ofembryogenic callus ofupland cotton（Gossypium hirsutum）with Agrobacterium tume faciens[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2005，81（2）：229-237.

［15］FIROOZABADY E，DEBOER D L，MERLO D J，et al.Transformation ofcotton by Agrobacterium tume faciens and regeneration of transgenic plants [J].Plant Molecular Biology，1987，10（2）：105-116.

［16］UMBECK P，JOHNSON G，BARTON K，et al.Genetically transformed cotton（GossypiUm hirsutuml L.）plants[J].Biotechnology，1987，5（3）：263-266.

Identification of Glyphosate Resistance Screening in Three Upland Cotton Hypocotyls

HE Jiming，LÜZunfu，JIANGJiuhua，LIFeifei

（College ofAgriculture and Food Science，Zhejiang Agriculture and Forestry University，Lin'an 311300，China）

For developing a transgenic cotton transformation system,in which glyphosate was used as a selective agent in high screening efficiency,the research adopted hypocotylfrom three varieties of WC,R15 and Xinluzao 45 ofupland cotton as experimental materials,and designed glyphosate solutions of six concentrations of 2.5,5,10,20,50,100 mg/L to carry out glyphosate susceptibility tests.The results showed thatoptimum concentrations ofglyphosate ofWC,R15 and Xinluzao 45 resistwere 5,20,10 mg/L,respectively. The research explained that hypocotyl of different upland cottons had differrent resistance to glyphosate.Selecting the appropriate concentration ofglyphosate was one ofthe keys to obtain the positive transformation.So,the research provides a technicalbasic for cotton genetic transformation,aim atimproving the screening efficiency oftransgenic cotton with glyphosate as the selective marker.

upland cotton;hypocotyl;glyphosate;resistance screening

S562

：A

：1002-2481（2017）09-1408-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.04

2017-05-27

国家自然科学基金青年基金项目（31401461）；2016年浙江农林大学校级教改项目（KG16001）；2016年浙江农林大学学生科研训练项目（113-2013200012）

何积明（1996-），男，浙江温州人，在读本科，研究方向：植物基因工程。李飞飞为通信作者。