基质金属蛋白酶及其特定抑制剂在肝纤维化形成中的作用研究进展

谭勤锐，李晖，杨琪，韩朋丽

(1成都中医药大学附属医院，成都 610072；2 成都中医药大学临床医学院)

基质金属蛋白酶及其特定抑制剂在肝纤维化形成中的作用研究进展

谭勤锐1,2，李晖1,2，杨琪2，韩朋丽2

(1成都中医药大学附属医院，成都 610072；2 成都中医药大学临床医学院)

肝纤维化是慢性肝病向肝硬化发展的必经病理过程，肝纤维化的形成主要源于基质金属蛋白酶(MMPs)及其特定抑制剂(TIMPs)的失衡引起细胞外基质(ECM)的异常沉积。MMPs主要降解ECM组分，而TIMPs可结合MMPs，导致胶原降解受限。对MMPs和TIMPs的功能进行更全面的研究，可对肝纤维化形成发展提供的新见解，有助于肝纤维化的防治。

肝纤维化；细胞外基质；基质金属蛋白酶；金属蛋白酶抑制剂

细胞外基质(ECM)即组织细胞外成分，由胶原、纤维连接蛋白、层黏连蛋白等组成，主要调节细胞运动和细胞间的相互作用，为组织、细胞的生长提供条件；ECM的异常累积可使胶原和非胶原组分的总含量增加3～8倍，使正常的低密度基底膜样基质向高密度间质型基质转化，最终引起肝纤维化[1]。基质金属蛋白酶(MMPs)及其特定抑制剂(TIMPs)在上述过程中发挥重要作用，MMPs主要降解ECM组分[2]，而TIMPs可结合MMPs，导致胶原降解受限[3]。 MMPs是参与ECM组分降解的具有锌和钙依赖性的蛋白水解酶家族[4]，目前已知成员有28个，基于其结构和底物不同可分为胶原酶类(MMP-1、8、13，底物有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ及Ⅸ型胶原)、明胶酶类(MMP-2和MMP-9，底物有Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型

胶原及弹性蛋白、层粘连蛋白等)、基质溶解素(MMP-7、11、26，底物有Ⅳ型胶原、糖蛋白、明胶等)、溶基质素(MMP-3和MMP-10，底物有Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原及蛋白聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白等)、膜型MMP(MMP-14、15、16、17、24、25，底物有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原及明胶、弹性蛋白、层粘连蛋白等[5])、其他(MMP-12、19、20、21、23、27、28，底物有蛋白聚糖、弹性蛋白等[6，7])。TIMPs是蛋白酶的特定抑制剂，对于活化的MMPs具有较高的亲和力,用于控制其活性[8]。目前已知的有4种,均含12个保守的半胱氨酸，其中TIMP-1的底物为MMP-1、3、7、9，TIMP-2的底物即MMP-2，TIMP-3的底物含MMP-2、9，TIMP-4底物包括MMP-2、MT1-MMP[6]。因此，通过对两者的调节可逆转和重塑ECM，从而达到治疗肝纤维化的目的。现就MMPs、TIMPs在肝纤维化形成中的研究进展作一综述。

1 MMPs在肝纤维化形成过程中的作用

1.1 MMPs的表达及分布 肝脏MMPs主要来源于静止和活化的肝星状细胞(HSC)、成纤维细胞或肌成纤维细胞及Kupffer细胞等，正常成人肝脏可检测到少量的MMPs，包括MMP-1、2、3、11、13[9]。通常情况下，MMPs以无活性的状态被分泌到细胞外环境或细胞膜上，可被丝氨酸蛋白酶或其他已活化的MMPs激活[10]，其活性的调节可发生在转录、转录后和蛋白水平，并受TIMPs调控。

MMPs表达的类型会根据细胞类型的不同而变化，如Kupffer细胞主要产生MMP-2、9、13，巨噬细胞表达MMP-12和MMP-13，肝细胞可表达MMP-2、3、10、13，还能表达TIMP-1和TIMP-2[11]；有些MMPs还具有特殊的分布部位，如肝纤维化时MMP-7高表达，主要定位在胆管上皮和门静脉周围的肝细胞，还可在内皮细胞和Kupffer细胞中表达。研究发现，MMPs表达与门脉周围纤维化分级呈正相关[12]。

1.2 肝纤维化发生时MMPs的调节功能 MMPs可调节一系列生物过程，包括免疫、组织重塑等，在ECM的降解和重塑中的作用是得到公认的；此外，它们还可作用于非ECM底物，如细胞因子和趋化因子，这些因子在肝损伤到肝纤维化形成的整个过程中均具有调节功能[13]。

各种因素导致MMPs活性失调后，通常会导致组织结构及功能改变，当发生肝损伤等病理情况时，MMPs的产生通常依赖于HSC的活性，此时的表达可被认为是肝组织对促炎细胞因子的应答。一系列炎症因子通过刺激Kupffer细胞释放大量的MMP-9，引起局部ECM降解；而另一方面，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达阳性细胞可产生不同量的MMP-2、9、13。因此，肝损伤早期MMP-2、9、13等的表达增加[14]。这些MMPs切割并激活转化生长因子-β(TGF-β)和血小板衍生因子(PDGF)，这两种因子均为促进肝纤维化形成的重要调节因子，故肝损伤后有向肝纤维化发展的趋势。肝损伤后期逐渐形成肝纤维化时，MMP-2、MMP-9等表达升高[15]；在肝纤维化后期阶段，由于TIMPs表达增加，MMPs不断失活，可见MMP-2、MMP-9等表达降低，导致过度的ECM积累，且有其他因素不断促进TGF-β、PDGF的表达和激活，纤维化过程逐渐被巩固。例如，细胞因子IL-1β由活化的单核细胞、巨噬细胞和树突细胞产生后，可诱导TNF-α、IL-6的产生，进一步诱导与中性粒细胞募集和成纤维细胞增殖相关的MMP的产生，并通过NF-κB和激活物蛋白1(AP-1)途径刺激TGF-β的转录，而且IL-1β的释放可启动与它相关的正反馈循环而大量增加，从而刺激纤维化的不断形成[16]。

各种MMPs对于肝纤维化的作用不一，如MMP-2表现为抗肝纤维化。Radbill等[17]进行体外研究时发现，外源性的MMP-2在重塑ECM的过程中主要是通过抑制而不是降解胶原蛋白来实现。MMP-8主要通过降解胶原蛋白而抗肝纤维化[18]，可降解Ⅰ、Ⅲ型胶原，并促进肝细胞生长因子表达和肝细胞增殖。MMP-9同MMP-2一样，均为研究者最感兴趣的明胶酶，在肝纤维化中的作用也相对最清楚，可降解Ⅳ型胶原(基底膜的主要成分)，参与慢性肝病的早期组织重塑[19]。MMP-13可促进肝细胞的增殖和损伤肝细胞的修复以实现组织重塑，从而起到抗肝纤维化作用。研究[20]发现，MMP-12表达减少时可引起肉芽肿相关的肝纤维化减轻，而表达增加时则可能通过抑制MMP-13的表达而促肝纤维化形成。MMP-14能够激活细胞膜上的MMP-2，具有抗纤维化和促纤维化双重作用[21]。众多研究表明，MMP-19可以降解各种ECM蛋白以抗肝纤维化；而Jirouskova等[22]研究发现，MMP-19基因缺失后会导致TGF-β信号传导减弱，从而减轻肝纤维化；进一步研究发现，MMP-19对于肝纤维化具有双重作用，即在肝损伤早期促纤维化形成，在解离期间则逐渐显示出抗肝纤维化[23]。

以上研究提示，MMPs既有降解和重塑ECM蛋白的作用，也有通过增强TGF-β信号传导而促肝纤维化形成的，为了研究某些新药的抗肝纤维化作用效果，研究者们通常需要在造模及用药后观察MMPs的表达情况，以明确药物的作用机制。

2 TIMPs的促肝纤维化作用

TIMPs来源于巨噬细胞、成纤维细胞等，主要作用是抑制MMPs活性。肝纤维化时，活化的HSC大量表达TIMP-1，除一些膜型MMPs(包括MMP-14、15、16、19、24)外，几乎可以抑制所有的MMPs。移植表达TIMP-1-siRNA的干细胞能够抑制大鼠肝纤维化的进展并恢复肝功能[24]，并发现其表达可诱导成纤维细胞的生长和增殖，并对MT1-MMP具有较弱的抑制能力，阻碍纤维化基质的清除，导致ECM累积[25]，提示TIMP-1是肝纤维化发展及加重的促成因素。TIMP-2可抑制MMP-2、9、14等对ECM蛋白的水解作用，还可以在pro-MMP-2、MT1-MMP之间形成复合物，通过促进MMP-2的活化间接控制ECM的降解，对成纤维细胞转分化具有强烈的效应[26]，提示TIMP-2也为促肝纤维化形成的因素。TIMP-3以不溶性形式与ECM结合，也能抑制MMPs的活性，可通过多种途径介导纤维化形成，包括从炎症控制到调节TGF-β1的激活；另外，发现它还具有保持肝内稳态的作用。TIMP-4可能是目前研究最少的，有关其作用的讨论也很少；但是，仍有研究显示其具有保护ECM蛋白免于水解的作用，可能与抑制MMP-9 、MMP-14的活性有关[27，28]。总而言之，TIMP可通过直接抑制ECM蛋白水解及间接控制ECM转变来实现促肝纤维化作用，由于TIMPs在体内半衰期短，因此目前还不能适用于药物的应用研究。但是，仍有许多MMP抑制剂正在努力研发中。

MMPs和TIMPs在肝脏生理条件和疾病进展过程中的特殊作用还远未被完全了解，除了它们传统的重塑ECM及处理某些非ECM组分的作用，我们需要对MMPs和TIMPs的功能进行更全面的研究，以提供对肝纤维化形成发展的新见解，从而有助于开发更多“定制”的方法来治疗急性和慢性肝病。

[1] Kurzepa J, Madro A, Czechowska G, et al. Role of MMP-2 and MMP-9 and their natural inhibitors in liver fibrosis, chronic pan- creatitis and non-specific inflammatory bowel diseases[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2014,13(6):570-579.

[2] Lukaszewicz-Zajac M, Mroczko B, Slowik A. Matrix metallo- proteinases (MMPs) and their tissue inhibitors (TIMPs) in amyotrophic lateral sclerosis (ALS)[J]. J Neural Transm, 2014,121(11):1387-1397.

[3] Vo NV, Hartman RA, Yurube T, et al. Expression and regulation of metalloproteinases and their inhibitors in intervertebral disc aging and degeneration[J]. Spine J, 2013,13(3):331-341.

[4] Almalki SG, Agrawal DK. Effects of matrix metalloproteinases on the fate of mesenchymal stem cells[J]. Stem Cell Res Ther, 2016,7(1):129.

[5] Marco M, Fortin C, Fulop T. Membrane-type matrix metalloproteinases: key mediators of leukocyte function[J]. J Leukoc Biol, 2013,94(2):237-246.

[6] Lindsey ML, Zamilpa R. Temporal and Spatial Expression of Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitors of metalloproteinases following myocardial infarction[J]. Cardiovasc Ther, 2012,30(1):31-41.

[7] Rietz A, Spiers JP. The relationship between the MMP system, adrenoceptors and phosphoprotein phosphatases[J]. Br J Pharmacol, 2012,166(4):1225-1243.

[8] Visse R, Nagase H. Matrix Metalloproteinases and tissue inhibitors of metallo- proteinases structure, function, and biochemistry[J]. Circ Res, 2003,92(11):827-839.

[9] Kuriyama N, Duarte S, Hamada T, et al. Tenascin-C: a novel mediator of hepatic ischemia and reperfusion injury[J]. Hepatology, 2011,54(6):2125-2136.

[10] Rukkumani R, Priyanka A, Sankar P, et al. Ferulic acid influences hepatic expression pattern of matrix metalloproteinases during alcohol and PUFA induced toxicity[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2012,16(15):2147-2153.

[11] Nunes de Carvalho S, Helal-Neto E, de Andrade DC, et al. Bone marrow mononuclear cell transplantation increases talloproteinase-9 and 13 and decreases tissue inhibitors of metalloproteinase-1 and 2 expression in the liver of cholestatic rats[J]. Cells Tissues Organs, 2013,198(2):139-148.

[12] Kerola A, Lampela H, Lohi J, et al. Increased MMP-7 expression in biliary epithelium and serum underpins native liver fibrosis after successful portoenterostomy in biliary atresia[J]. J Pathol Clin Res, 2016,2(3):187-198.

[13] Parks WC, Wilson CL, Lopez-Boado YS. Matrix metalloproteinases as modulators of inflammation and innate immunity[J]. Nat Rev Immunol, 2004,4(8):617-629.

[14] Guedes PL, Castaon MC, Nagaoka MR, Aguiar JAK. Increase of glycosaminoglycans and metallo- proteinases 2 and 9 in liver extracellular matrix on early stages of extrahepatic cholestasis[J]. Arq Gastroenterol, 2014,51(4):309-314.

[15] Peng J, Li X, Feng Q, et al. Anti-fibrotic effect of Cordyceps sinensis polysaccharide:Inhibiting HSC activation, TGF-b1/Smad signalling, MMPs and TIMPs[J]. Exp Biol Med, 2013,238(6): 668-677.

[16] Robert S, Gicquel T, Victoni T, et al. Involvement of matrix metalloprotei- nases (MMPs) and inflammasome pathway in molecular mechanisms of fibrosis[J]. Biosci Rep, 2016,36(4):e00360.

[17] Radbill BD, Gupta R, Ramirez MC, et al. Loss of matrix metalloproteinase-2 amplifies murine toxin-induced liver fibrosis by upregulating collagen Ⅰ expression[J]. Dig Dis Sci, 2011,56(2):406-416.

[18] Siller-López F, Sandoval A, Salgado S, et al. Treatment with human metalloproteinase-8 gene delivery ameliorates experimental rat liver cirrhosis[J]. Gastroenterology, 2004,126(4):1122-1133.

[19] Duarte S, Babe J, Fujii T, et al. Matrix metalloproteinases in liver injury, repair and fibrosis[J]. Matrix Biol, 2015(44-46):147-156.

[20] Endo H, Niioka M, Sugioka Y,et al. Matrix metalloproteinase-13 promotes recovery from experimental liver cirrhosis in rats[J]. Pathobiology, 2011,78(5):239-252.

[21] Giannandrea M, Parks WC. Diverse functions of matrix metallo-proteinases during fibrosis[J]. Dis Model Mech,2014,7(3):193-203.

[22] Jirouskova M, Zbodakova O, Gregor M, et al. Hepatoprotective effect of MMP-19 deficiency in a mouse model of chronic liver fibrosis[J]. PLoS One, 2012,7(10):e46271.

[23] Han YP, Yan C, Zhou L, et al. A matrix metalloproteinase-9 activation cascade by hep- atic stellate cells in trans-differentiation in the three-dimensional extracellular matrix[J]. J Biol Chem, 2007,282:12928-12939.

[24] Wang K, Lin B, Brems JJ, et al. Hepatic apoptosis can modulate liver fibrosis through TIMP1 pathway[J]. Apoptosis, 2013,18(5):566-577.

[25] Arpino V, Brock M, Gill SE. The role of TIMPs in regulation of extracellular matrix proteolysis[J]. Matrix Biol, 2015,44(46):247-254.

[26] Jezierska A, Motyl T. Matrix metalloproteinase-2 involvement in breast cancer progression: a mini-review[J]. Med Sci Monit, 2009,15(2):32-40.

[27] Mishra PK, Givvimani S, Chavali V, et al. Cardia matrix: a clue for future therapy[J]. Biochim Biophys Acta, 2013,1832(12):2271-2276.

[28] Takawale A, Fan D, Basu R, et al. Myocardial recovery from ischemia- reperfusion is compromised in the absence of tissue inhibitor of metallo-proteinase 4[J]. Circ Heart Fail, 2014,7(4):652-662.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.038

R575

A

1002-266X(2017)34-0109-03

2016-12-28)

四川省科技厅科技支撑计划项目(2017FZ0052)；四川省中医药管理局中医药科学技术研究专项(2016C036)；四川省科技厅重点研发项目(2016FZ0093)。

李晖(E-mail: 1400124746@qq.com)