ABAT基因多态性对癫痫患儿丙戊酸钠血药浓度的影响

张贵萍，杨冰竹，李磊，赵静，潘焕，张云梅

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563003)

ABAT基因多态性对癫痫患儿丙戊酸钠血药浓度的影响

张贵萍，杨冰竹，李磊，赵静，潘焕，张云梅

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563003)

目的观察ABAT基因多态性对癫痫患儿丙戊酸钠血药浓度的影响。方法收集癫痫患儿80例，单用丙戊酸钠10～30 mg/kg治疗5个半衰期(约100 h)后达到稳态；取外周静脉血，采用荧光偏振免疫法测定丙戊酸钠血药浓度，用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性计数分析ABAT(rs1731017、rs1641022)基因多态性，比较不同基因型对丙戊酸钠血药浓度的影响，用多元线性回归分析影响丙戊酸钠血药浓度的因素。结果80例患者中，ABAT rs1731017位点AA、GG、GA基因型分别为23、23、34例，ABAT rs1641022位点CC、AA、CA基因型分别为11、27、42例。血药浓度为(48.15±20.99)μg/mL，其中ABAT rs1731017位点AA基因型为(36.41±20.12 )μg/mL，低于GG基因型患儿的(53.26±22.99)μg/mL(P<0.05)，ABAT rs1641022各基因型患儿血药浓度均无统计学意义(P均>0.05)。多元线性回归分析显示，患儿体质量及ABAT rs1731017A/G多态性是影响丙戊酸钠血药浓度的独立因素。结论ABAT rs1731017基因多态性对丙戊酸钠的血药浓度存在影响，对AA基因型癫痫患儿可适当增加药物的剂量。

癫痫；丙戊酸钠；ABAT基因；基因多态性；血药浓度;儿童

癫痫是临床上常见的神经系统慢性疾病，我国癫痫发病率约为0.7%，其中60%于小儿时期起病[1]。丙戊酸钠(VPA)是一线传统抗癫痫药之一，其对全面性癫痫的失神发作、肌阵挛和强直-阵挛发作都有一定疗效；但是，丙戊酸钠有治疗指数低、安全范围窄、疗效个体差异大等缺点，此外遗传因素也对其代谢及药效有明显影响。丙戊酸钠是一种代谢途径及作用机制非常复杂的药物，涉及到多种代谢途径。目前研究比较多的是Ⅰ相细胞色素P450酶(CYP450)的代谢和Ⅱ相尿苷酸二磷酸葡萄糖醛酸酶(UGT)的羧化作用[2，3]。研究[4]发现，丙戊酸钠能提高抑制神经递质γ氨基丁酸(GABA)水平从而发挥抗癫痫作用，其主要途径是通过抑制γ氨基丁酸转氨酶(GABAT)活性。ABAT基因是GABAT的编码基因，存在rs1731017A/G、rs1641022C/A突变[5]。为此，本研究应用多聚酶链反应(PCR)对170例丙戊酸钠单药治疗的癫痫患儿ABAT基因多态性进行分析，评估ABAT基因多态性对丙戊酸钠代谢的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年8月～2014年8月遵义医学院附属医院门诊的癫痫病患儿80例，男40例、女40例，年龄(4.16±1.85)岁，体质量(9.96±3.98)kg，均经询问临床症状、神经系统体格检查、脑电图、头部CT/MRI检查后确诊为癫痫，每年发作频率超过2次。排除就诊前有使用其他抗癫痫药物者，肝肾功能异常者，有结构性或进行性脑部疾病者，合并其他遗传代谢疾病者，资料不全、依从性差者。本研究所有患儿或其监护人均签署知情同意书，并取得医院伦理委员会的批准。

1.2 丙戊酸钠服用方法及血药浓度监测 单药服用丙戊酸钠糖浆(德巴金，杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司)，日剂量为10～30(15.52±5.58)mg/kg。患儿在服药后经5个半衰期(约100 h)后达到稳态，于清晨空腹服药前采血4 mL，将一半血液置于普通试管中用于丙戊酸钠血药浓度的测定。应用西门子血药浓度检测仪采用荧光偏振免疫法(FPIA)测定丙戊酸钠血药浓度，每份标本测2次，取其平均值。为消除患儿体质量和服药剂量对血药浓度的偏差，将检测的血药浓度除以患儿每日每公斤体质量的服药量得到患儿的标准血药浓度。

1.3 ABAT rs1731017、rs1641022基因多态性分析 将血液标本的另外一半置于EDTA抗凝试管中4 ℃保存，在2 h内用DNA提取试剂盒(美国Omega公司)完成DNA样本提取，采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测 ABAT rs1731017、rs16410222位点的多态性。采取Primer5.0软件设计引物序列，ABAT rs1731017上游引物为5′-TATGATGGGCCTCTGATGAAG-3′、下游引物为 5′-CTAAGCTTGGCTGTGCCTTTG-3′，rs16410222上游引物为 5′-CTCCCACGGGTGTTTATTTCT-3′、下游引物为5′-GCTCCAACTCACAGCATTAGG-3′，由上海生工公司合成。PCR反应体系：DNA模板60 ng，上下游引物浓度均为0.2 μmol/L，dNTPs浓度为200 μmol/L，1×buffer及1 U TaqDNA聚合酶，加入去DNA酶水至25 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；4 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35个循环；72 ℃ 5 min。扩增结束后，扩增产物由3%琼脂糖凝胶电泳定性。ABAT基因型判断标准：rs1731017A/G、rs1641022C/A相应产物分别经AvaⅠ和RsaⅠ内切酶(大连宝生物公司)37 ℃水浴过夜，用3%琼脂糖凝胶电泳分离，根据分离片段长度判断基因型。ABAT rs1731017 基因型AA(126 bp)、AG(126、46、80 bp)、GG(46、80 bp)，ABAT rs1641022 基因型AA(224 bp)、AC(224、150、74 bp)、CC(150、74 bp)。

2 结果

2.1 癫痫患儿ABAT rs1731017、rs1641022基因多态性检测结果 ABAT rs1731017位点AA基因型23例(28.75%)、GG基因型23例(28.75%)、GA基因型34例(42.50%)，ABAT rs1641022C位点CC基因型11例(13.75%)、AA基因型27例(33.75%)、CA基因型42例(52.50%)。

2.2 癫痫患儿血药浓度检测结果 80例癫痫患儿血药浓度为(48.15±20.99)μg/mL，其中ABAT rs1731017位点AA、GG、GA基因型分别为(36.41±20.12 )、(53.26±22.99)、(47.94±18.99)μg/mL，ABAT rs1641022位点CC、AA、CA基因型分别为(43.69±18.78)、(51.15±22.83)、(49.15±21.24)μg/mL。ABAT rs1731017位点AA基因型患儿血药浓度低于GG型患儿(P<0.05)，其余同位点不同基因型间两两比较均无统计学差异。

2.3 癫痫患儿ABAT rs1731017、rs1641022基因多态性与血药浓度的关系 通过多元线性回归分析患者性别、年龄、体质量、日剂量、ABAT rs1641022C/A多态性、ABAT rs1731017A/G多态性对丙戊酸钠血药浓度的影响，仅有患者体质量(Sb= 0.008，bi=0.837，P=0.000)及ABAT rs1731017A/G多态性(Sb=0.045，bi=-0.136，P=0.038)2个因素纳入回归方差。回归方程为丙戊酸钠血药浓度(μg/mL)=0.629+0.110×体质量(kg)-0.095×ABAT rs1731017A/G(AA=1、GG=2、GA=3)。

3 讨论

丙戊酸钠是一种广谱抗癫痫药，广泛应用于癫痫的治疗中，尤其适用于全面性癫痫，常作为一线抗癫痫药物使用；但是，在临床使用过程中存在疗效差异性大的缺点。儿童患者肝肾功能尚未完全发育，比成年人更容易出现药物不良反应。丙戊酸钠的不良反应往往与其血药浓度有着密切的关系。丙戊酸钠血药浓度的影响因素比较多，患儿的遗传因素、生理特征、病理因素及患儿的服药依从性是导致血药浓度变化的重要因素[6，7]。本研究通过多元线性回归发现，患儿的体质量及ABAT rs1731017A/G多态性都会对血药浓度产生影响。

研究[8]发现，体质量低于10 kg者丙戊酸钠血药浓度与剂量低度相关，而体质量大于30 kg则二者存在中度相关，说明体质量与血药浓度存在密切的关系。本研究也得到了类似的结论。其原因可能是体质量越小的低龄儿童代谢旺盛，其药物清除速率越快，血药浓度就越低。因此，对于年龄小、体质量低者应该适当增加单位剂量以获得更稳定的血药浓度水平，保证抗癫痫治疗效果；而体质量偏大者则应选择偏小的单位剂量，保证疗效的同时避免产生药物不良反应。

丙戊酸钠在体内主要有三种代谢途径，其中40%是通过线粒体β氧化。各种代谢途径均涉及到多条药理通路，多种受体和通道参与其中，如钠离子通道基因、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、ABAT基因、钙离子T型阻滞剂的CACNA1I、CACNA1H等等[11]。 因此，编码这些酶和受体的基因突变都会引起丙戊酸钠的代谢发生变化，从而使得患者在疗效上存在巨大差异。 ABAT基因位于16号染色体的13区2带，其主要功能是编码GABAT参与GABA的分解代谢[9]。当GABAT不足时，就会引起GABA含量升高，出现神经精神兴奋性的症状，如难治性的癫痫发作和脑电图的异常。Barnby等[10]研究发现，ABAT基因表达水平与GABAT的活性存在一定的关联。当ABAT基因发生多态性改变时，会导致GABAT水平发生改变，从而导致GABA含量发生改变，从而影响丙戊酸钠的代谢及临床疗效。

此外，ABAT还能促进二磷酸脱氧核糖核苷转化为三磷酸脱氧核糖核苷，这样能够维持线粒体膜的功能和线粒体呼吸链复合物的活性[12]。本研究结果发现，ABAT rs1641022中等位基因C的频率是28.75%、等位基因A的频率是66.25%，ABAT rs1731017A/G中等位基因G频率是50.00%、等位基因A的频率是50.00%，此结果与其他学者研究结果类似[5]。本研究显示，ABAT rs1731017A/G(Gln/Arg)中AA型携带者比GG型携带者标准化的丙戊酸钠血药浓度显著降低。其原因可能是由于基因的突变，导致其编码的氨基酸发生改变。谷氨酸(Glu)是中枢神经系统中最主要的兴奋性神经递质，脑内Glu水平增高与癫痫有着密切的关系。有研究[13]证实，丙戊酸钠通过调节星形胶质细胞的Glu释放水平从而控制Glu能神经元的活性，达到治疗癫痫的作用。本研究发现，ABAT rs1731017A/G由于基因的突变，导致其编码Gln的含量不同。Gln是神经元合成Glu的原料，从而导致丙戊酸钠血药浓度的改变。因此认为，ABAT的多态性与儿童癫痫患者丙戊酸钠的代谢有密切关系，是影响患儿丙戊酸钠血药浓度及临床疗效的一个重要因素。但是本组也存在一定的局限之处：首先样本量较小，可以拟扩大样本量进行进一步研究；另外，癫痫是一种多基因共同影响的疾病，受到多条通路多个基因的调控，而且环境因素也会对疗效产生一定的影响。因此，ABAT基因多态性对癫痫患儿丙戊酸钠血药浓度的影响尚需进一步研究证实。

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本刊2017年57卷第30期104～107页文章《尿源性干细胞在医学实验研究中的应用进展》中，基金项目为江苏高校品牌专业建设工程一期项目(PPZY2015B161)，通信作者为陈凤鸿(E-mail: 254279976@qq.com )。特此声明。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.021

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