水稻遗传转化方法研究与应用进展

许惠滨，朱永生，连 玲，蒋家焕，江敏榕，谢华安*，张建福*

（1.福建省农业科学院水稻研究所，福建福州 350019；2.农业部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室/福州（国家）水稻改良分中心/福建省作物种质创新与分子育种省部共建国家重点实验室培育基地/杂交水稻国家重点实验室华南研究基地/福建省作物分子育种工程实验室/福建省水稻分子育种重点实验室，福建福州 350003）

转基因技术已成为植物分子生物学研究的有效手段，更是研究基因克隆和功能基因组不可或缺的工具。近年来，遗传转化方法不断创新、增多。早在20世纪80年代末和90年代初，人们就利用聚乙二醇（PEG）法、脂质体法、电击法、基因枪法以及花粉管通道法等DNA直接导入基因转化法进行水稻的遗传转化［1-4］。直到20世纪90年代中期，农杆菌介导法才开始被应用于水稻的遗传转化［5］。虽然直接转化法有许多优点，但因其操作繁琐、外源基因插入多拷贝性、不完整性、转化率较低以及外源DNA的整合机制、表达调控和遗传规律等理论问题还不清楚等等一系列缺点，而不被广泛采用。与直接转化法相比，农杆菌介导法具有费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短、能转化较大片段等独特的优点，而且在理论上和技术上操作都比较成熟，因此倍受青睐。文章现对水稻遗传转化的几种方法进行简单综述，对比它们的优缺点及应用情况。

1 PEG法

PEG法是植物遗传转化研究中较早建立且应用广泛的一个转化系统。其主要原理是化合物聚乙二醇（PEG）、多聚L-鸟氨酸（pLO）和磷酸钙在高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。具有对细胞伤害少、避免嵌合体产生、受体不受限等优点。总的来说，PEG直接转化法在目前具有一定的应用价值，特别是禾本科植物的遗传转化，利用该法已使许多禾本科植物成功获得转基因植株，如水稻。但是由于它以原生质体为受体，易产生白化苗，转化率低，而且建立原生质体的再生系统比较困难［6］，所以没有被广泛推广。

2 脂质体法

脂质体（Liposome）法是根据生物膜的结构和功能特征，用脂类物质合成的双层膜囊将DNA 或RNA 包裹成球状，导入原生质体或细胞中，以实现遗传转化的目的。根据操作方法的不同，把脂质体法分为两种：a.脂质体融合法（liposome fusion），即先将脂质体与原生质体共培养，使它们发生膜融合，然后利用原生质体的吞噬作用，使其将脂质体内的外源DNA或RNA分子转入其内，最后通过原生质体的再生培养，产生新的植株；b.脂质体注射法（liposome injection），即通过显微注射把含有外源DNA或RNA分子的脂质体注射到植物细胞中，以获得成功转化的方法。

3 电击法

电击法（Eletroporation）又称为电穿孔法，其原理是利用高压电脉冲作用于受体细胞膜上，使其形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA或RNA的摄取。电击法具有操作简便，转化率高，对受体细胞无特殊选择性且适于瞬时表达研究等优点。缺点是电穿孔易损伤原生质体，降低其再生率；而且该法必须经过原生质体培养，而原生质体的分离比较繁琐；同时电击法所用的仪器比较昂贵。将电击法与PEG法和脂质体法等结合使用，有效地提高了转化效率。此外，随着“电注射法”的发明与应用，省略了原生质体的制备过程，不但提高了植物细胞的存活率，而且简便易行，现已在水稻上获得转基因植株［7］。

4 基因枪法

基因枪法（Particle gun）又称微弹轰击法（Microprojectiole bombardment），其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，利用高压将微粒高速射入受体细胞，微粒上的外源DNA进入细胞后，随机整合到植物基因组中，实现外源基因的转化。与其它遗传转化方法相比，基因枪转化法具有无宿主限制；靶受体类型广泛，可以是胚、愈伤组织，也可以是悬浮细胞或其他细胞、组织［8］；可控度高；操作简便快速，甚至可克服无菌操作困难等优点，这使其成功应用于植物遗传转化，特别是单子叶植物。然而，它也存在一些缺点及需要改进的问题。由于基因枪轰击的随机性，外源基因进入宿主基因组的整合位点相对不固定，拷贝数往往较多，这样转基因后代容易出现突变、外源基因容易丢失且易引起基因沉默，不利于外源基因在宿主细胞的稳定表达［9］，此外基因枪的价格昂贵、运转费用高，使其没有被广泛应用。

5 花粉管通道法

花粉管通道法（Pollen-tube pathway）的主要原理是：利用植物受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵中，并进一步整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而形成携带有目的基因的新个体。它有效地利用了植物自然生殖过程，避开了植株再生的难题，而且转化不受基因型限制，操作简单，转化成本也较低，与农杆菌介导法相比，它可以得到大量未经初步筛选的种子。因此，建立一种准确、快速、有效的检测方法就成为花粉管通道转化法的关键技术。然而它也存在一些不足之处，如技术不太完善，对转化机制缺乏系统的研究，操作过程带有一定的盲目性，且随机性强，转化效率较低等［10］。

6 农杆菌介导法

农杆菌介导的转化系统是一种天然的转化系统。存在根癌农杆菌和发根农杆菌两类转化植物细胞的农杆菌，它们均普遍存在于土壤中，属于革兰氏阴性细菌，能够自发感染大多数双子叶植物的受伤部位。在根癌农杆菌和发根农杆菌的细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上都有一段T-DNA（T-DNA region）， 即 转 移 -DNA（transfer-DNA），又称为T区（T region），农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，将T-DNA插入并整合到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。水稻遗传转化中较常使用的是Ti质粒，还未见有关Ri质粒对水稻遗传转化的报道［11］。

6.1 农杆菌介导水稻遗传转化的研究

农杆菌介导转化法已成功应用于许多双子叶植物，然而在单子叶植物特别是禾本科植物中的应用起初却发展缓慢，这主要是因为单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，农杆菌无法将外源DNA整合到单子叶植物基因组中。然而，随着农杆菌侵染机理的进一步研究，对Ti质粒进行有效的修饰，使其成为单子叶植物的理想转化载体。1986年，Baba 等［12］采用聚乙二醇（PEG）法将农杆菌与水稻原生质体融合起来，得到了一部分能够合成胭脂碱的胚性愈伤，开创了农杆菌介导水稻遗传转化的新篇章。从此，人们对农杆菌介导的水稻遗传转化展开了广泛的研究。1990年Raineri等［13］以及1992年Chan等［14］分别以成熟胚和离体根为材料，均未得到任何转基因植株。1993年报道了首例农杆菌介导的粳稻幼胚遗传转化［15］，表明农杆菌介导的水稻转化取得了正式成功。随后，Hiei等［16］于1994年实现了对粳稻的高频转化，转化率高达28.6%。至此，农杆菌介导的水稻遗传转化技术得到了突破性进展，并逐渐迈向成熟。

在最近的十几年里，农杆菌介导的水稻遗传转化更是取得了显著进展。首先是1996年，Rashid等［17］利用农杆菌介导法成功转化籼稻Basmati系列水稻，接着Dong等［18］也成功转化了爪哇稻；其次，Zhang等［19］以幼胚和胚性愈伤组织为外植体，通过对外植体进行真空浸透处理，显著提高了转化率 ；随后，林拥军［20］、Lin and Zhang［21］分别建立了农杆菌介导的粳稻和籼稻的高效转化体系；2006年，Seiichi Toki等［22］把诱导5 d的水稻成熟胚愈伤直接用于农杆菌侵染，并成功获得转基因植株，这样不仅避免了体细胞在继代过程中所产生的突变，而且大大缩短了整个转化周期；2009年，Lin and Zhou等［23］利用穿刺法成功进行粳稻的农杆菌介导转化，这种方法不经愈伤的诱导，转化周期比快速转化法更短。

6.2 影响农杆菌介导水稻遗传转化率的因素

农杆菌介导的水稻遗传转化是农杆菌菌株与水稻细胞互作的结果，凡是能够影响农杆菌侵染力和水稻细胞转化应答能力以及转化子再生能力的各种因素，均可对转化的效果产生影响，归结起来主要包括两个方面：一是农杆菌侵染体系；二是水稻的组织培养与再生体系。

6.2.1 农杆菌侵染体系 在农杆菌介导的水稻遗传转化中，选择正确的菌株与载体组合至关重要。不同的农杆菌菌株具有不同的宿主范围，所以不同的菌株对同一受体的转化效率存在差别。根据侵染能力的强弱，农杆菌可分为普通菌株和超毒菌株，超毒菌株是通过对普通菌株的进一步改造获得的，如EHA101和EHA105。近来的研究又衍生出了一种超毒菌株以外的新的转化体系，即超双元载体［24］。为了克服单子叶植物对农杆菌转化敏感性差的问题，利用超毒力菌株和超双元载体，增强农杆菌的侵染能力和T-DNA的整合能力，从而有效地提高了转化效率［25］。水稻转化中常用的菌株为普通菌株LBA4404和超毒菌株EHA101，EHA105和AGL1等。1998年，刘巧泉等［26］以及后来易自力等［27］分别对比了 LBA4404、EHA105和 AGL1三种农杆菌菌株对水稻愈伤组织的转化能力，发现三者存在差异，其中EHA105菌株的转化效果最好，因此，目前水稻的遗传转化普遍使用超毒菌株EHA105。

Vir基因位于Ti质粒上，它能够激活T-DNA的转移，使农杆菌表现出毒性。Vir区由VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG及VirH等7个互补群基因组成，它的活化对于T-DNA的加工、运输和整合发挥着至关重要的作用。

选择标记的功能是在特定的选择压力下把转化体选择出来，为了实现这一目的，首先要在筛选培养基中加入特定的选择剂，使其产生一定的选择压力，使得未转化的细胞不能生长和发育。其次，选择标记基因的产物对选择剂具有抗性，从而使转化细胞不受选择剂的影响，正常生长和发育，最终实现转化体的选择。

6.2.2 水稻的组织培养与再生体系 水稻基因型也是影响遗传转化效率的主要因素之一。1986年，Abe and Futsuhara等［28］对66种不同的粳稻和籼稻品种进行组织培养，发现不同品种的可培养性存在显著性差异。尽管粳稻［29］、籼稻［30］和爪哇稻［31］都已经建立了相应的农杆菌遗传转化体系，然而不同的水稻品种对农杆菌的敏感程度不一样，通常粳稻的转化较易成功，且转化率高，而籼稻，则比较困难，再加上籼稻愈伤诱导和再生不敏感［32］，其转化率通常不超过10%［31］。

选择适合的转化受体是实现基因转化的先决条件。目前认为植物体的任何组织和器官都可以作为转化的外植体，然而由于它们的脱分化和再分化能力、细胞全能性及感受态程度等存在很大的差别，即使同一组织器官的不同部位的差异也是显著的。因此不同的外植体，培养的效果不同。通常选择幼年型、增殖能力强、具有较强再生能力且遗传稳定性好的外植体，如胚、顶端分生组织、幼穗等。水稻中的幼胚和成熟胚均是很好的转化受体，虽然幼胚的转化效率较成熟胚高，但由于幼胚的取材受时间和空间的限制，而成熟胚取材方便，且不受季节限制，因此水稻的遗传转化主要以成熟胚作为转化受体。

一个好的再生系统需要有一种最佳的培养基与之相适应。迄今为止已研制出许多基本培养基的配方，主要有MS、NB、N6和CC等，它们既有共性，也存在特异性。其中共性主要表现在都含有无机盐、有机成分和蔗糖等，特异性则表现在所含成分的种类或含量不同。不同的水稻品种对培养基的要求不一样，其中NB适合粳稻和籼稻愈伤组织的诱导。同时在组织培养过程中，通常会往基本培养基中添加适量的不同种类的激素，它们的主要功能表现在促进细胞分裂、诱导愈伤组织和生根等。

7 讨论

选择适合的转化受体是实现水稻遗传转化的先决条件。人们已成功利用水稻的幼胚、成熟胚、叶片和幼穗等进行愈伤组织的诱导。这些不同的分生组织与器官的愈伤诱导率与质量却存在显著差异，其中幼胚的诱导率最高，且愈伤质量最好，其次是成熟胚。可是由于幼胚要在水稻开花10～15 d内取材，而且要及时消毒，不能放置太久，受时间和空间限制，而成熟胚取材方便，不受季节限制，因此通常以水稻的成熟胚作为转化受体。

愈伤组织褐化是影响愈伤组织质量的重要因素之一。褐化是指外植体在组织培养过程中，由于机械损伤造成伤口处分泌出酚类化合物，有氧条件下，酚氧化酶催化氧化酚类物质产生醌，醌再通过非酶促反应产生有色物质而导致组织褐变，并逐渐扩散到培养基中，抑制其它酶的活性，毒害整个外植体。褐化抑制愈伤组织的生长，并影响其发育。造成愈伤组织褐化的因素有很多，包括外植体的基因型和生理状态、培养基和培养条件等。不同基因型的外植体在诱导和继代培养过程中的褐化率不一样，因此，在相同的培养条件下，应选择褐化程度相对较轻的外植体。培养基的成分以及所含激素的种类和含量都会影响愈伤组织的褐化率。通过往培养基中加入适量的激素以调节培养基的渗透压，减少细胞过度吸水，最终降低愈伤组织褐化死亡的频率。培养条件也是引起愈伤组织褐化的主要原因，包括温度、pH值以及继代时间等。

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