如何提高ELISA测定的准确性

高秀妹 曹红收 刘占艳/山东省无棣县畜牧兽医局

如何提高ELISA测定的准确性

高秀妹 曹红收 刘占艳/山东省无棣县畜牧兽医局

近几年，畜产品质量安全意识与日俱增，动物疫病形势复杂化，基层动物疫病防控部门做好动物疫病筛查工作显得尤为重要。酶联免疫吸附试验（ELISA）因其具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点被广泛应用于血清、尿、饲料等样品筛检中。ELISA试验看似简单但在实际的操作中，影响测定结果的因素较多，稍有不慎便会导致弱板、白板、花板等不正常现象或假阳性、假阴性等异常结果。笔者对ELISA测定过程中出现一些问题进行了分析和总结，要想做好ELISA试验需三个方面着手。

一、试剂

检测试剂应选择正规厂家、灵敏度高、特异性好、操作方便省时的试剂，切忌混用同厂家生产的不同批号的试剂。另外，试剂在使用前应平衡至室温（25℃）,这样可以避免试验反应不充分、弱阳性样品检测假阴性结果等现象的发生。此外，稀释试剂的水必须使用重蒸水或去离子水，其他水因杂质过多或有酸碱度都会影响检测结果的准确性。

二、样品

1.样品处理。ELISA测定结果的判定是通过辣根过氧化物酶（HRP）与特异性结合产生的抗原-抗体复合物相互作用后显色与否来实现的。对样品筛选或处理要严格，否则会直接导致结果呈假阳性或假阴性等异常现象。如溶血和被细菌污染的样品、冰箱中保存过久的样品等导致假阳性出现；反复冻融会使样品效价降低，导致假阴性出现。一般来说，一周内测定的4℃～8℃冷藏保存，一周后测定的-20℃冷冻保存，长期保存多次测定的样品要分装冰冻保存。

2.样品稀释。凡是ELISA检测试剂盒，均要求将样品稀释至适当的倍数，并且不同试剂盒对样品稀释倍数均有严格规定，以降低非特异反应的概率，同时保证试验的灵敏度和特异性。若操作者未能理解其意义，没有严格按照说明书操作，导致移取计量不精准，造成样品稀释倍数相差甚远，那么检测结果肯定会出现严重偏差。

三、操作

1.加样。首先加样不可太快，否则无法保证加样剂量的准确性和均一性。其次要避免将液体加在反应孔壁上部，可能会导致非特异性吸附。此外，要做到一份样品一个移液抢头，以防交叉污染。

2.温育。温育是ELISA测定中的一个关键环节，只有在一定适宜的温度和与之相对应的特定时间，液相中的抗原（抗体）才能与固相载体上的特异抗体（抗原）充分结合。不同试剂盒有不同的温育温度和时间的要求，应严格按试剂盒说明操作，不能人为改变。此外，微孔板温育时要加贴封片，这样可以防止孔内液体蒸发或水珠等杂质滴入孔内影响检测结果。

3.洗板。洗板是将温育过程中液相非特异性成分与反应中固相载体的抗原（抗体）结合产生的抗原抗体清除出去，从而保证ELISA测定的特异性。同样，每个试剂盒对洗板的次数和侵泡时间都有明确规定，绝不能擅自更改。此外，洗涤液应现用现配，洗板时不要让洗液溢出，每次甩板拍干后的吸水纸一定要更换，尤其是拍过酶标记物的吸水纸，否则影响试验结果。

4.显色。一般来说，显色时间过短，结果偏低，显色时间过长，对照值偏高或非特异性显色概率增加，因此，显色一定要严格按照说明书要求控制好时间。此外，不同试剂盒对酶标仪的波长有明确要求，上机时需稍加注意。

此外，在反应板上的整个操作过程，操作手法应一致，加样时避免产生气泡，以免反应不完全或比色结果不准确。

总之，只要操作者按照说明书要求操作，专心细致，精益求精，就一定能大大降低异常结果出现的概率，体现ELISA试验的优越性。