HBV DNA整合与肝癌关系的研究进展

方向，邓伟

(广西医科大学附属肿瘤医院 广西壮族自治区肿瘤防治研究所，南宁530021)

·综述·

HBV DNA整合与肝癌关系的研究进展

方向，邓伟

(广西医科大学附属肿瘤医院 广西壮族自治区肿瘤防治研究所，南宁530021)

乙型肝炎病毒(HBV)与人基因组整合在肝细胞癌发生和发展过程中发挥关键作用。目前研究表明，HBV包含编码表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X蛋白的4个开放阅读框(ORF)，均可以形成断裂位点整合到人基因组，其整合率从高至低依次是X区、S区、C区和P区。HBV在人染色体上的整合位点并非随机分布，而是存在与肝癌相关的潜在优势整合位点，这些优势整合位点附近的基因常常涉及到细胞生长、增殖、分化和永生化。HBV DNA整合入人基因组后，通过影响整合位点周围基因功能、形成具有致癌作用的HBV截短蛋白以及增加人染色体的不稳定性促使肝细胞的癌变。

乙型肝炎病毒；DNA整合；肝细胞癌；宿主基因组；遗传信息；染色体异位；碱基缺失

肝细胞癌(简称肝癌)是常见恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤的第3位。全球每年有大约60万人死于肝癌，其中将近一半发生在中国[1]。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是我国肝癌最重要的危险因素，在HBV慢性感染期间，HBV可以通过DNA整合来影响整合位点周围基因功能，破坏或促进对细胞生长和分化至关重要基因的表达，从而促进肝细胞恶性转化[2]。目前研究[3～6]证实，HBV DNA可通过整合进入宿主基因组促使肝细胞癌变。现将HBV整合与肝癌关系的研究进展综述如下。

1 HBV整合的机制与特点

1.1 HBV整合机制 1980年人们首次在HBV相关性肝癌患者体内中检测到HBV DNA与人染色体整合[7]。HBV复制过程中存在反转录这一特殊阶段，人体感染HBV后，HBV病毒成熟体通过黏附进入到肝细胞，HBV DNA疏松的环状结构(rcDNA)首先转变为闭合环状DNA(cccDNA)，接着cccDNA转录为前基因组RNA(pgRNA)进入细胞质，然后反转录为rcDNA，rcDNA再次进入肝细胞核循环。在cccDNA的循环中，部分rcDNA可能复制失败，形成双链线型DNA(d1DNA)，d1DNA可以在断裂DNA修复过程中再次整合入宿主基因。同时，HBV感染可造成其双链DNA断裂(DsBs)，DsBs修复途径可以把不同来源的非邻近的DNA片段拼接起来，这就为HBV整合入宿主基因提供了分子基础。HBV整合至宿主基因组中有利于其持续感染，长期慢性炎症可以导致肝细胞生命周期改变和增殖，增加宿主基因组DNA终端数量，反过来又有利于HBV DNA整合到宿主基因组中[8]。

1.2 HBV整合特点 HBV是具有松弛环形部分双链的DNA病毒，全长3 200 bp，由长短2条链组成。其中长链为负链，携带编码HBV蛋白的所有遗传信息，其包含编码表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X蛋白的4个重叠的开放阅读框(ORF)。理论上4个ORF均可以形成断裂位点插入到人基因组，但研究发现它们整合的频率并不相同，其整合率从高至低依次是X、S、C、P，目前尚无完整HBV DNA整合到人基因组的病例报道。HBV这4个ORF在与人染色体整合后会重新排列，这种排列紊乱会导致基因表达异常，如果这种异常不断叠加，最终会促使细胞癌变。

X基因是HBV DNA中最小的一个ORF，Jiang等[9]对癌组织与癌旁组织进行对照，发现癌组织和癌旁组织中均存在整合，HBV整合部位平均分布在DR1和DR2附近。但屠红等[10]对40例肝癌病例整合位点的研究发现，HBV DNA整合可发生在X基因的任意长度，并非只出现在HBV DR1和DR2区，X基因有96%以截短形式插入宿主细胞DNA。研究表明，C-末端截短的HBX可以通过Stat3/Nanog级联反应增强肝癌干细胞样特性，在肝癌发生发展过程中发挥重要作用[11]。另外，C-末端截短的HBX可以促进CD133肝癌干细胞亚型的出现，并在肝癌中表现出恶性和干细胞样特征，通过激活法尼酯衍生物X受体(FXR)介导癌症干细胞作用[12]。HBX蛋白作为反式激活因子，可以影响调节性非编码RNA(ncRNA)，包括microRNA和长ncRNA，HBX也参与表观遗传修饰和DNA修复，HBX与各种信号转导途径相互作用，如p53、Wnt和核因子-κB通路[13]。另外，X蛋白还可引起肝癌中p21、p16、p62myc、c-myc、p2lras等癌基因和抑癌基因高表达[14，15]。另一个经常出现断裂整合的HBV基因是pre-S2/S基因，其编码3种不同结构相关的包膜蛋白，pre-S2蛋白可以作为反式激活因子，并与人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子相互作用，增加端粒酶活性[16]。pre-S2/S基因还可以产生截短的pre-S2/S蛋白，在大量肝癌组织中可以检测到截短的pre-S2/S蛋白，这种截短的蛋白有与c-myc和c-fos相类似的反式激活作用，可以通过激活与转录相关的级联反应，提高肝细胞的增生率[17]。

HBV整合可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，Ⅰ型整合起始于DRl向负链3端延伸；Ⅱ型整合也起始于DRl，但延伸方向和Ⅰ型相反；Ⅲ型整合起自DR2向负链3端延伸；Ⅳ型整合也起自DR2，延伸方向和Ⅲ型相反。Chauhan等[18]报道，土拨鼠在感染HBV和土拨鼠肝炎病毒1 h后，其肝组织内可以检测到HBV和土拨鼠肝炎病毒DNA及其复制中间体，同时可以检测到HBV DNA整合到宿主基因中，在感染后1 h和3 h可以检测到土拨鼠肝炎病毒X和pre-S序列插入宿主基因组。该研究证实自然条件下的肝炎病毒在入侵后不久就可以整合入肝细胞DNA。

2 HBV在人染色体上的整合位点

目前在人23对染色体中均发现HBV DNA的整合，因此有学者认为，HBV DNA在人染色体中的整合是随机的[19]。但是，随着对HBV DNA整合研究的深入以及第二代测序技术的发展，越来越多的整合位点被发现。有研究表明，在癌组织中，HBV在染色体5、8、10、19中整合常见，在癌旁组织中，HBV在1号和2号染色体上整合更常见；每个染色体上的整合位点数量与非肿瘤组织中脆性位点的数量相关，而与肝癌组织无关[20]。Zhao等[22]发现，HBV倾向于整合在染色体脆性位点和包括CpG岛的功能基因区，并且优先整合17号染色体[21]。近年研究显示，HBV整合存在相对热点区段，HBV整合倾向于发生在染色体转录区域和重复序列，包括长散布核元素(LINE)、短散点核因子(SINE)和Alu序列。尽管目前所发现的热点整合位点只能代表总体事件中的一小部分，但是反复发生的整合插入位点表明HBV存在与肝癌相关的潜在优势整合位点。最常见的HBV整合事件位于TERT和骨髓/淋巴或混合白血病4(MLL4)，TERT在覆盖细胞衰老中起重要作用，细胞衰老通常在大多数癌细胞中上调，MLL4编码组蛋白甲基转移酶，其在癌基因组的表观遗传修饰中具有关键作用。目前已经发现的HBV DNA在人基因组上整合的肿瘤相关靶基因有100多个，包括MLL4、TERT、纤连蛋白1、SMAD家族成员5SMAD5、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白E1、Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子GEF12、磷酸酶和肌动蛋白调节物4、钙信号相关基因、RNA结合蛋白fox-1同系物、醇脱氢酶1B、氨基甲酰磷酸合成酶1、雌激素相关受体γ、视黄酸诱导的1、CTD小磷酸酶、低密度脂蛋白相关性蛋白1B、sentrin特异性肽酶5、PDGF受体等，这些基因涉及到细胞生长、增殖、分化和永生化。

3 HBV DNA整合致肝癌的主要机制

Jiang等[23]报道，在60例HBV相关性肝癌患者癌组织及癌旁组织中都存在相同的X基因C-末端截短基因，此外，两组的病毒序列具有相似的C1653T、A1762T/G1764A低频率突变，HBV插入的频率和模式在癌组织和癌旁组织之间相似，表明大部分HBV DNA整合事件与肝癌的发生无关。关于HBV整合的致癌机制，有研究认为HBV整合的相关基因突变和HBV整合引起的染色体稳定性改变与肝细胞癌变有关。但是，目前普遍认为HBV整合导致肝癌的机制包括以下3个方面。

3.1 影响整合位点周围基因的功能 Cao等[24]使用名为“病毒扫描”的生物学信息系统，在3例肝癌患者癌组织中发现HBV整合到KMT2B基因，但对应的癌旁组织未发现，由此推测HBV整合诱导宿主驱动基因的改变可能会促使病毒癌基因表达和肝癌进展。HBV基因组携带着诸多转录调控相关元件，如增强子1、增强子2、负性调控元件、核心上游调节序列、基本核心启动子等，HBV DNA通过整合嵌入人基因的转录调控区域，通过这些调控元件影响HBV整合位点周围基因功能，从而导致肝癌发生。

3.2 形成具有致癌作用的HBV截短蛋白 在HBV相关性肝癌中存在有大量截短的X蛋白，Tu等研究显示，全长的X蛋白可以抑制ras与myc引起的集落生长的功能，截短的X蛋白可以加强ras与myc的转化功能。整合的HBV DNA能够表达合成成熟的pre-S/S和X蛋白触发级联信号转导，同时也可以促使肝细胞恶变。

3.3 增加人基因的不稳定性 HBV DNA整合到人基因组可引起人染色体DNA的缺失和易位以及细胞DNA的扩增和融合转录产物的产生，从而增加基因组DNA的脆性和不稳定性。在肝癌组织中可以检测到17p13、4q32、llpl4、4q32、11q13等区域的小片段缺失，有研究[25]在肝癌组织中发现HBV DNA整合位点两端出现17号与18号染色体易位，并且18号染色体整合位点附近出现碱基缺失。

4 展望

目前已经初步探明了HBV的整合机制，并检测到了一些常见整合位点和受累基因，其中Pang等[26]通过量化HBV DNA与肝癌患者白细胞基因组的整合，确定OR4F3和OR4F17的组合是HBV相关疾病的新型潜在生物标志物。但是，对于HBV DNA整合导致肝细胞癌变的确切机制目前尚不完全清楚。HBV DNA整合与肝癌的关系非常复杂，不仅需要精心设计的流行病学研究，还需要对常见整合基因进行体外细胞功能试验和动物模型试验，为肝癌的预防和治疗提供理论基础和实验依据。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.034

R735

A

1002-266X(2017)42-0102-03

国家自然科学基金资助项目(81260319)。

邓伟(E-mail: 9608946@qq.com)

2017-06-21)