影响禽流感血凝和血凝抑制试验的因素及对策

2017-04-04郑海玲广东省汕头市潮南区动物疫病预防控制中心

兽医导刊 2017年15期

郑海玲/广东省汕头市潮南区动物疫病预防控制中心

郑海玲/广东省汕头市潮南区动物疫病预防控制中心

HA-HI作为全球流感监测的常用试验方法可以用于鉴定流感病毒分离株HA亚型，也可以对禽血清中是否存在抗原亚型相同的免疫抗体进行检测。这种方法操作简单、方便、灵敏度高，在基层动物防疫部门得到广泛应用。但是很多因素会导致HA-HI试验结果失真，难以取得预期检测效果，下面将对相关影响因素与对策具体探究。

一、处理与保存血清

1.溶血。很多因素影响下会使溶血形成，比如，注射器清洁不当，容器不干燥或者受到污染；穿刺方法不正确，损伤了组织；长时间的淤血；过快的抽血速度；将血液向容器中注入，未能将针头取下或者过快的注入速度使大量泡沫产生，久而久之会形成溶血；过于剧烈的震荡，这些都需要在操作中格外注意。可以在采血时应用一次性注射器，让血清在注射器中自然析出，可以降低溶血发生率。

2.血清分离。采集完的血液呈45～60º角于室温（20℃～25℃）下放置约2～3h即可分离出血清，条件允许时可先将采好的血液呈45～60º角于4℃冰箱放置约1h，然后用低速离心机离心3～5min，转速为3000～5000转。

3.胶冻样血清。在采集血样中，因为血液中存有过多脂肪会出现胶冻样血清，处理这种血清的方法是应用干净的玻璃棒或者塑料棒挑起胶冻样的血清，在管壁上挤压，直到胶冻样消除为止，然后快速离心，这样可以快速获得检测用的血清样。

4.保存血清。血清通常在冰箱中冷藏，5℃为适宜温度。如果检测用的样品需要保存1周，需要放置冷冻箱中。保存好的血清一定要做好标记与封闭处理，避免弄混。有的血清样品需要反复检测，就需要多次冻融，这样将难以确保检测结果准确。有研究人员将30份抗体水平较高的血清作为试验样本，分为①组、②组和③组，①组为被检测血清反复冻融，②组为检测抗原，也反复冻融，③组为对照组。3组均做血凝抑制试验，结果显示：①组抗体水平较对照组低1个滴度，②组抗体水平较对照组低2个滴度。由此，反复冻融会影响到检测结果，尽量确保样品反复冻融次数低于5次，必要时可分装血清样品。

二、选用器材

1.微量血凝板。可以重复使用微量血凝板，也可以使用一次性的塑料反应板，有机反应板如果清理不当或者出现破损会使试验精度降低，由此，在使用反应板过程中按照规定步骤与清洗程序清理，一旦发现有机反应板磨损或者破损需停止使用。而应用一次性塑料反应板则可以不用反复清洗，也不会出现磨损问题。

2.微量移液器。多道与单道微量移液器是两种类型，在使用微量移液器之前需要鉴定或者校正，按照标准方法使用微量移液器，一定要牢固安装吸头，避免安装后出现脱落、漏气等情况，用手按压时力度需要恰当、均匀，液体吸取时需要缓慢进行，然后再缓慢的松开；吸头管嘴浸入到液面的深度也要控制好，这样可以将误差尽量减少。

3.吸头。非一次性吸头需要彻底清洗干净，可使用高温灭菌法或者超声波清洗法，使吸头保持无菌状态，当前，一次性吸头使用较多，但是也要检查好质量，在使用微量移液器时，确保安装的吸头管嘴是齐平的。

三、试验操作

1.缓冲液。可以将 pH=7．2、0．01mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS）作为稀释液，现用现配，尽量不使用生理盐水替代缓冲液。

2. 1%红细胞悬液。红细胞悬液的配制应用公鸡2只或2只以上，通常选择的公鸡无禽流感与其他疫病，如果选用免疫公鸡，需要适当将洗涤次数与时间增加，且在红细胞洗涤时将表面白细胞膜去除，不然将对红细胞敏感度造成影响。血清来源相同的禽种红细胞作为试验血清的来源较为合适，可以将非特异情况消除。

3. 4个血凝单位抗原。血凝试验先将抗原作为试验对象，抗原效价则为抗原与红细胞完全凝集的孔，再按照抗原效价，将4个血凝单位抗原配比成，现用现配，可减少浪费与污染，不能反复冻融，也不能放置在常温下超过5 h。为了确保4个血凝单位抗原配制准确，可开展回归试验在HI试验前。

4.加样。试验过程中将需要检测的血清、4个血凝单位抗原以及PBS加入，还要加入1%红细胞悬液。在加样过程中，需要在使用抗原与红细胞前摇晃均匀，这样才能使每个孔中的浓度是相同的，提高试验精度。不能让吸头碰触到U型或者V型板孔，这是预防交叉污染的重要一步。可以在U型或者V型板底部加样加物，不能在孔壁上方加样，还要防止渗出；血清倍比稀释时，不能将移液器的吸头随意调整，始终保持在液面中，避免产生气泡，保证移液量的准确。