寻常型银屑病皮损组织中miR-138、hTERT、K17的表达及意义

冯世军，李华蕊，张广静，王正想，杨秀芳

(沧州市中心医院，河北沧州061001)

寻常型银屑病皮损组织中miR-138、hTERT、K17的表达及意义

冯世军，李华蕊，张广静，王正想，杨秀芳

(沧州市中心医院，河北沧州061001)

目的观察寻常型银屑病皮损组织中miR-138、hTERT、K17的表达，分析三者之间的相互关系。方法选择28例寻常型银屑病患者(观察组)和24例健康对照者(对照组)，取其皮肤组织，采用实时荧光定量PCR法检测miR-138表达，Western blotting法检测hTERT、K17蛋白表达。采用Pearson相关分析miR-138与hTERT、K17及hTERT与K17表达水平的相关性。结果与对照组相比，观察组皮损组织中miR-138表达降低，hTERT、K17蛋白表达升高(P均<0.05)。miR-138表达与hTERT、K17表达均呈负相关(r=-0.623、-0.789，P均<0.01)，hTERT与K17表达呈正相关(r=0.683，P<0.01)。结论寻常型银屑病皮损组织中miR-138表达降低，hTERT、K17蛋白表达升高；miR-138可能参与角质形成细胞的异常增殖，通过靶向调节hTERT而上调K17蛋白的表达。

寻常型银屑病;微小RNA；人端粒酶逆转录酶；K17

银屑病是由T细胞介导的慢性炎症性皮肤病，其中以寻常型银屑病最为多见。目前银屑病的病因和发病机制尚不清楚，可能与遗传因素、环境因素、免疫、新生血管、脂代谢紊乱、心态等有关[1]。据报道，银屑病的一般治疗方法为局部紫外线照射、甲氨蝶呤、环孢素A、阿曲汀和生物制剂治疗[2]。随着研究的深入，细胞因子、信号分子和微小RNA(miRNA)逐渐成为寻常型银屑病的潜在治疗靶点[3，4]。miRNA结合于mRNA的UTR区，能够通过加速转录过程或miRNA转录产物的降解过程而抑制翻译进程[5]。miRNA的异常表达与肿瘤、心血管疾病和炎症性疾病等[6]的发生有关。最近关于某些特异性miRNA在银屑病中的作用也逐渐受到关注，如hsa-miR-99a、miR-146a、miR-486-3p、miR-155、miR-203和miR-125b[4，7]。作为miRNA家族的一员，miR-138通过调节靶标基因参与肿瘤转移和分化、DNA损伤和细胞衰老等一系列生理反应[8]，以往研究表明，miR-138的过量表达能够降低人端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白的表达，从而调节端粒酶在多种肿瘤中的活性，如恶性成神经细胞瘤、甲状腺癌和子宫颈癌。K17属于Ⅰ型上皮角质素(酸性)，通过向角质形成细胞提供机械支持保护表皮的完整性[6]。然而，miR-138与hTERT、K17在寻常型银屑病中的表达变化及意义目前尚不明确。本研究通过观察寻常型银屑病皮肤组织中miR-138、hTERT、K17的表达，进一步分析三者之间的相互关系，以期为寻常型银屑病寻找新的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2015年6月～2017年1月我院收治的28例寻常型银屑病患者(观察组)，其中男15例、女13例，平均年龄31.4岁。入选标准：①病理诊断为寻常型银屑病；②3个月内未服用免疫抑制剂、糖皮质激素和维甲酸等药物；③1个月内无寻常型银屑病外用药物或光照治疗；④无其他皮肤病、自体免疫性疾病、肿瘤或其他严重疾病；⑤患者非妊娠期、哺乳期或月经期。对照组为我院烧伤科收治的24例患者，其中男11例、女13例，平均年龄32.2岁。患者均无银屑病史及家族史，无其他自身免疫性疾病，无肿瘤或其他严重疾病。两组性别、年龄具有可比性。本研究获得我院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 miR-138检测 采用实时荧光定量PCR法。收集患者的皮肤组织，加入液氮研磨，使用RNA提取试剂盒(Qiagen)提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度，控制OD260/280在1.7～2.1。将RNA反转录成cDNA，于ABI7500进行qRT-PCR反应。PCR条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 34 s，共40个循环。miR-138上游引物5′-GGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′，下游引物5′-AACTTCACAACACCAGCTTA-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA -3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6基因为内参，根据内参基因绘制标准曲线，计算目的基因的相对表达量。

1.3 hTERT、K17蛋白检测 采用Western blotting法。收集患者的皮肤组织，以中性蛋白酶处理，4 ℃过夜，充分研磨处理后，加入细胞蛋白裂解液，离心取上清液，应用BCA试剂盒测定蛋白浓度，煮沸5～10 min后，-20 ℃冻存。SDS-PAGE蛋白电泳后转移至PVDF膜，封膜后加入兔抗人和鼠抗人K17抗体，4 ℃过夜，加入HRP标记的羊抗兔IgG抗体和HRP标记的兔抗鼠IgG抗体，37 ℃孵育1 h，一抗和二抗均购自Santa Cruz Biotechnology。以GAPDH为内参进行化学发光成像，以目的蛋白占内参蛋白的百分比计算目的蛋白相对浓度。

2 结果

2.1 两组皮肤组织中miR-138表达比较 观察组和对照组皮肤组织中miR-138的相对表达量分别为1.12±0.24、2.08±0.31，观察组miR-138表达低于对照组(P<0.05)。

2.2 两组皮肤组织中hTERT、K17蛋白表达比较 观察组hTERT、K17的表达量分别为0.78±0.11和0.67±0.12，对照组分别为0.34±0.06、0.28±0.04。观察组hTERT、K17蛋白表达高于对照组(P均<0.05)。

2.3 miR-138与hTERT、K17蛋白表达的相关性 miR-138表达与hTERT、K17表达均呈负相关(r=-0.623、-0.789，P均<0.01)，hTERT与K17表达呈正相关(r=0.683，P<0.01)。

3 讨论

miRNA是一种长约22个核苷酸的非蛋白质编码的小分子RNA，在转录后水平调节蛋白质编码基因的表达。miRNA是细胞生长、增殖、分化、凋亡和信号转导的关键调节物质，参与免疫系统的调节以及慢性炎症反应的发病机制，其表达的改变会导致疾病的发生。银屑病是具有遗传易感性的个体在内外环境的共同作用下，由T细胞介导的常见慢性复发性炎症性皮肤病。以往研究发现，多种miRNA参与银屑病的发病机制，包括miR-203、miR-146、miR-125b、miR-21、miR-221、miR-222以及miR-155等[9]，这些miRNA在银屑病皮损组织中呈非正常表达模式，不同程度地参与银屑病角质形成细胞的增殖、分化和凋亡。本研究结果显示，观察组皮损组织中miR-138表达低于对照组，表明miR-138可能与同一家族中其他miRNA成员共同参与了银屑病的发生发展过程。

研究表明，银屑病皮损处表皮角质形成细胞中hTERT的表达水平显著增高，提示银屑病皮损中hTERT活性增加可能与银屑病发病有关[10]。hTERT mRNA只在恶性肿瘤组织及某些有高度再生潜力的组织如银屑病中表达，与端粒酶活性表达一致，被认为是端粒酶活性的决定因素。以往研究显示，在银屑病皮损处可以检测到较高水平的端粒酶表达，而正常皮肤则不表达或表达低水平的端粒酶活性，说明端粒酶可能参与细胞的增殖调控。本研究表明miR-138在银屑病皮损中的低表达与hTERT呈负相关，推测hTERT的表达上调导致端粒酶活性升高，促进角质形成细胞的异常增殖，从而参与银屑病的发生发展进程。

K17被认为是“银屑病相关性细胞角蛋白”，与链球菌M蛋白具有相同的序列ALEEAN，可特异性刺激银屑病T细胞，使之活化、释放IFN-γ等炎症因子，而IFN-γ又能够经STAT1信号通路上调K17表达，使机体产生针对K17的自身免疫反应，从而形成一个恶性环路，导致炎症反应和角质形成细胞异常增生等病理改变，成为银屑病发病过程中的关键环节。因K17在银屑病皮损中呈高表达以及其具有刺激T细胞活化的作用，被界定为银屑病自身反应性T细胞识别的候选靶抗原。以往研究证实，在银屑病的病理过程中存在“K17-T细胞-细胞因子环路”，该环路可能是银屑病皮损持续存在和反复发作的重要基础[11，12]。近年来，许多学者也在不断尝试研究以K17作为靶点治疗银屑病的方法。本研究表明，miR-138与K17的表达呈负相关，结合miR-138在银屑病皮损中的表达低于正常皮肤组织，我们推测miR-138在银屑病皮损中的低表达引起K17表达升高，从而促进银屑病的发生发展，如果能够利用miRNA药物来抑制K17表达，可能起到治疗和缓解银屑病的目的。孙中斌等[7]研究证实，miR-486-3p在银屑病皮损中通过K17 3′UTR种子序列结合抑制K17表达，说明miRNA对K17的调控作用参与银屑病的发生和发展。

hTERT表达与K17呈正相关，然而关于二者之间相互作用的机制尚不清楚。K17在银屑病皮损中的高表达刺激T细胞分泌IFN-γ，IFN-γ对细胞的刺激可以引起STAT蛋白聚集到IFNγR Ⅰ受体链的单个STAT结合位点上，进而可被JAK1/JAK2激活，之后STAT从受体上游离、形成二聚体，进入细胞核内，与干扰素激活部位增强子家族结合，参与信号转导。JAK-STAT信号通路在多种疾病的病理改变中均扮演着重要角色，研究表明STAT3可以通过结合在TERT启动子特定位点引起TERT表达升高[13]。因此我们推测，银屑病皮损中K17表达升高促使细胞分泌IFN-γ和IL-2增多，进而激活JAK-STAT信号通路，从而上调hTERT的表达。

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