SiRNA在肝纤维化基因治疗中的应用进展

罗媛元，王丽娜，殷子斐

(1第二军医大学，上海200433；2第二军医大学附属长海中医医院)

SiRNA在肝纤维化基因治疗中的应用进展

罗媛元1，王丽娜2，殷子斐2

(1第二军医大学，上海200433；2第二军医大学附属长海中医医院)

肝纤维化是各种慢性致病因素作用于肝脏，引起组织损伤修复的病理反应，是多种肝脏疾病发展至肝硬化的必经阶段。小干扰RNA(siRNA)能够高效、特异地破坏mRNA的完整性，抑制疾病相关基因的表达，在基因治疗领域有广阔应用前景。目前研究表明，siRNA能有效地从基因水平进行调控，抑制肝星状细胞的活化与增殖，增加细胞外基质的降解，可成为肝纤维化治疗的有效手段。

肝纤维化；肝星状细胞；小干扰RNA；基因治疗

肝纤维化是肝脏对各种病因造成肝脏慢性损伤的修复反应。目前，肝纤维化的治疗方法主要包括去除致病因素、缓解肝纤维化本身。肝纤维化是一种可逆性损伤，如不能得到及时有效控制，则会进展为肝硬化[1]。近年来，随着人们对肝纤维化发生机制的不断深入，肝纤维化基因治疗亦逐渐成为抗肝纤维化的研究热点。基因治疗能将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病。RNAi干扰(RNAi)是指生物进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)介导的、细胞内同源信使RNA(mRNA)的降解现象[2]。作为RNAi技术的一种，小干扰RNA(siRNA)容易制备，且能高效、特异地沉默靶基因，在基因治疗领域有广阔应用前景，并逐渐成为未来药物研发的新方向。现就近年来siRNA在肝纤维化治疗中的应用进行综述如下。

1 siRNA的结构及特点

siRNA由Dicer(RNAase Ⅲ家族中对dsRNA有特异性的酶)加工而成，其长度为20～25个核苷酸。作为非编码RNA家族中的一员，siRNA具有两条链，分别为正义链、反义链。其中，反义链能与多种核酸酶结合形成基因沉默复合物(RISC)。在依赖ATP的解螺旋酶作用下，siRNA的双链被打开，mRNA的特定片段取代siRNA正义链的位置，与siRNA的反义链互补，随后核酸酶将mRNA切割成21～23个碱基的小基因片段，从而起到沉默目的基因的作用[3]。

siRNA作为RNAi进行基因沉默的最常用的手段，有以下特点：①特异性：siRNA中的反义链能与mRNA中的同源区特异性地结合；②高效性：siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用放大[3]。正因为如此，siRNA逐渐被认为是一种基因沉默的强大工具，亦是目前新药研发的热门方向之一。siRNA是降解mRNA的强效工具，能针对肝纤维化形成过程中多个靶点的基因进行调控，达到抗纤维化的作用。

2 肝纤维化的机制

肝纤维化是在持续损伤影响下，肝脏愈合过程中的代偿反应，其病理特征是细胞外基质(ECM)在肝内过多沉积。肝纤维化发生的常见致病因素：病毒感染、免疫功能紊乱、胆汁淤积、药物毒性作用、中毒和代谢性疾病等。肝纤维化进一步加重，ECM通过形成致密纤维包裹再生肝细胞结节，破坏肝脏结构，最终形成肝硬化。肝纤维化的形成过程复杂，但可简要概括为以下两个环节：①肝星状细胞(HSC)细胞的活化增殖；②活化后的HSC分泌ECM，造成ECM在肝脏过度堆积。具体而言，当肝脏受到病理因素的刺激，发生炎性损伤后，肝脏内的淋巴细胞、Kuffer等炎症细胞被活化，释放转化生长因子(TGF)β、血小板源性生长因子(PDGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、肿瘤坏死因子(TNF)等炎症因子，从而使HSC从静止状态进入活化增殖状态。与此同时，激活的HSC增加细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的含量，使得未转化的HSC向肌成纤维细胞(MFB)转化，加重肝纤维化的进展。当HSC被激活后，其分泌的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白和层黏连蛋白等ECM增多，且HSC进一步分泌基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1、TIMP-2，引起基质金属蛋白酶(MMP)/TIMP调节失衡，从而导致ECM降解相对不足，过多沉积在肝内，形成肝纤维化[4]。

3 siRNA治疗肝纤维化的机制

3.1 抑制HSC的活化增殖，从根本上减少ECM的合成 ①抑制TGF-β/Smad表达：TGF-β广泛存在于动物正常组织细胞及转化细胞，属于调节细胞生长和分化的细胞因子家族，具有5种亚型，含量最多的为TGF-β1。TGF-β是目前公认最能有效促进活化HSC的刺激因子，亦是基因治疗肝纤维化的经典靶点之一[5]。早在2009年，我国学者Xu等[6]使用伴刀豆球蛋白A对昆明小鼠进行免疫型肝纤维化造模，并在此过程中，采用快冲方法尾静脉注射含有靶向TGF-β1siRNA的质粒pGenesil-TGF-β1(0.8 mL/10 g体质量)，结果显示治疗组中TGF-β1、Smad3表达明显下降，肝纤维化程度较模型组明显减轻。随后，2011年，我国研究者Lang等[7]使用高脂、高胆固醇饲料饲养SD大鼠，并同时皮下注射四氯化碳(CCl4)，在此基础上尾静脉注射TGF-β1siRNA，发现TGF-β1siRNA能明显降低大鼠肝脏的TGF-β1、Ⅰ和Ⅲ型胶原，减轻肝纤维化程度，且高剂量(0.25 mg/kg)较低剂量(0.125 mg/kg)更加有效。

Smad蛋白是近年来发现新的分子家族，其是将TGF-β1信号直接由细胞外转导入细胞核内的重要胞内效应因子，在肝纤维化发生中起重要作用。我国学者罗海峰等[8]构建了Smad2 siRNA，发现其能使HSC细胞内的Smad2表达明显下降，并使细胞上清中的Ⅲ型胶原含量明显降低。在此基础上，该课题组采用CCl4SD大鼠肝纤维化模型，结果显示尾静脉注射含有Smad2 siRNA的质粒能显著肝脏组织中的Smad2含量，减低肝纤维化的病理评分[9]。随后，赵加斌等[10]体外研究证实：Smad2 siRNA能有效抑制TGF-β对HSC的激活，阻断TGF-β/Smad传导通路，使Ⅰ型胶原分泌下调，从而发挥抗肝纤维化作用。除了使用Smad2的siRNA之外，诸多研究显示针对Smad3的siRNA亦能起到缓解肝纤维化的作用。如刘晓兵等[11]研究发现，siRNA-Smad3可显著上调p53表达、下调Bcl-2，抑制HSC增殖，并诱导HSC凋亡；Wang等[12]对CCl4干预后的大鼠皮下注射脂质体包裹的Smad3 siRNA，结果发现：大鼠肝脏内的胶原沉积明显减少，血清中的透明质酸、层黏连蛋白及Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白含量均明显下降。

② 抑制CTGF表达：CTGF是一种新发现的促成纤维细胞分裂和胶原沉积的生长因子，不仅可直接介导原代HSC活化、增殖及迁移，且能促进活化HSC，并使其合成与分泌ECM，被比作为肝纤维化形成的“总开关”，逐渐成为抗肝纤维化治疗的新靶点[5]。早在2006 年，Li等[13]通过门静脉给大鼠注射CTGF siRNA(0.1 mg/kg)，能显著降低CCl4作用后的SD大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原、层黏连蛋白，缓解肝纤维化的进展程度。2008年，George 等[14]报道CTGF siRNA能使腹腔注射N-二甲基亚硝胺(DMN)大鼠体内的CTGF、TGF-β1表达明显下降。随后不久，Chen 等[15]对人脂肪肝患者的肝脏组织标本进行分析，证实活化的HSC细胞是产生CTGF的场所，并且他们对人、鼠的正常HSC进行处理，发现乙醇能导致显著上调CTGF、α-SMA、TGF-β1表达。在此基础上，该课题组证实：使用CTGF siRNA可明显降低HSC内的α-SMA含量，抑制Ⅰ型胶原表达，从而说明CTGF siRNA在酒精型肝纤维化的防治中有重要意义。2014年，Hao等[16]将携带有CTGF siRNA基因的慢病毒载体(LV)注射到注射经CCl4作用后大鼠的门静脉后，发现：大鼠肝脏内的CTGF表达明显下降，血清中的透明质酸以及ALT显著降低，肝脏的胶原减少，纤维化程度降低。③抑制PDGF/PDGFR表达：PDGF主要存在于血小板中，但在肝脏受损的情况下，巨噬细胞、血小板、浸润的炎细胞、受损的内皮细胞及激活的肝星形细胞均可合成PDGF。PDGF具有三种形式的二聚体亚型，分别为PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC。PDGF生物学效应的发挥需要与靶细胞表面的血小板源性生长因子受体(PDGFR)结合[5]。研究表明，肝纤维化发生过程中，在HSC细胞膜表面，PDGF-BB与PDGFR-β的作用尤为突出。针对HSC细胞表面受体PDGFR-β进行RNAi，可有效发挥抗肝纤维化效应。Chen 等[17]构建了含有PDGFR-β siRNA的质粒，首先体外转染了HSC，证实了该质粒能有效沉默PDGFR-β的表达，接着通过快冲方法将该质粒尾静脉注射DMN或胆总管结扎的肝纤维化SD大鼠，在两种动物模型上证实：含有PDGFR-β siRNA的质粒能明显下调大鼠肝脏的PDGFR-β、α-SMA表达，降低血清ALT、胆红素含量及肝纤维化病理程度等级。为进一步增加RNAi的靶向性，该课题组使用了具有细胞特异性的胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子，发现该启动子能在体内体外实现PDGFR-β siRNA在HSC中的特异性高效表达，从而实现靶向抗肝纤维化的作用[18]。④抑制高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/RAGE表达： HMGB1属于慢性炎症因子的一种，参与肝纤维化的进程。现已证实：HMGB1能与HSC细胞表面的晚期糖基化终末产物受体(RAGE)结合，其结合力为晚期糖基化终末产物与RAGE结合力的7倍，随后进一步活化HSC细胞[19]。随着这一作用机制的揭示，不少学者发现针对HMGB1/RAGE通路进行基因沉默，可达到抗肝纤维化进展的目的。Ge 等[20]将HMGB1基因特异性siRNA以脂质体包裹，转染HSC细胞后，细胞内的HMGB1的表达明显下降，α-SMA和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量下降，HSC细胞增殖受到明显的抑制。Xia等[21]对CCl4造模的肝纤维化SD大鼠，尾静脉注射脂质体包裹的RAGE siRNA，结果发现大鼠血清ALT、总胆红素减少，肝脏细胞内的RAGE、α-SMA、NF-κB、Ⅰ型胶原含量降低，且大鼠肝脏的炎症程度、纤维化程度明显减轻。此外，Wang等[22]研究证实：RAGE siRNA缓解CCl4作用后SD大鼠的肝脏纤维化程度与RAGE siRNA在蛋白、基因层面下调炎症因子TNF-α、IL-6有关。

3.2 直接调节ECM的合成与降解，减少ECM的堆积 ①调节PAI-1/尿激酶(uPA)平衡：ECM在肝脏内的累积，是肝纤维化产生的病理基础。uPA能直接降解ECM，并能激活MMP，发挥间接降解ECM的作用。纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)是纤溶系统重要的调控因子，其能与uPA的丝氨酸活性中心结合，使其活化作用丧失。在肝纤维化发生过程中，PAI-1的含量明显增加，uPA的活性受到明显抑制，不能及时有效地降解ECM[23]。因此，考虑到PAI-1/uPA在肝纤维化进程中的失衡作用，可通过降低PAI-1活性，提高uPA相对含量的方法，达到增加降解ECM的效果。Hu等[24]证实了经CCl4作用后的大鼠，肝脏中的PAI-1及Ⅰ、Ⅲ型胶原明显增加，随后他们构建了PAI-1 siRNA，发现当PAI-1 siRNA转染到HSC细胞后，细胞内α-SMA、TGF-β、TIMP-1、Ⅰ和Ⅲ型胶原的表达显著下降，细胞增殖率降低。随后，他们进一步将携带有PAI-1siRNA基因的腺病毒(Ad)尾静脉注射SD大鼠，通过对DMN和胆总管结扎两种动物模型进行验证，发现大鼠肝脏内的PAI-1含量下降，TIMP-1表达增加，MMP-9、MMP-13表达上升，I型胶原减少，肝细胞的凋亡比例下降[25]。② 调节MMP/TIMP平衡：MMP是机体降解细胞外纤维性胶原的主要酶家族，受到TIMP的直接调控。肝脏中含有TIMP-1和TIMP-2，由内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞等分泌。TIMP能按1∶1比例与MMP的活性位点以可逆的非共价形式结合，抑制基质降解酶的活性。在肝脏受损情况下，肝脏内MMP/TIMP平衡体系被打破，导致MMP相对不足，进一步引起ECM在肝脏过多沉积，从而造成肝纤维化[26]。近年来，不少学者尝试用siRNA技术对MMP/TIMP进行调节，起到了良好的抗肝纤维化效果。

综上所述，肝纤维化是肝损伤导致肝脏修复的病理反应，亦是各种肝病进展成肝硬化的必经阶段。siRNA能高效特异沉默体内目的基因，一方面可通过抑制TGF-β、Smad、CTGF、PDGFR、HMGB1、RAGE表达，减少HSC的活化，从而减少ECM的产生，另一方面可调节PAI-1/uPA、TIMP/MMP平衡，增加ECM的降解，显示出较好的抗肝纤维化效果。siRNA还可通过沉默细胞外信号调控激酶2、大麻类受体CB1、瘦素、前胶原等基因表达，发挥抗肝纤维化作用。

[1] 马振增,陆伦根.肝纤维化药物治疗的新进展[J].临床肝胆病杂志,2016,32(6):1183-1187.

[2] Borna H, Imani S, Iman M, et al. Therapeutic face of RNAi: in vivo challenges[J]. Expert Opin Biol Ther, 2015,15(2):269-285.

[3] Gavrilov K, Saltzman WM. Therapeutic siRNA: principles, challenges, and strategies[J]. Yale J Biol Med, 2012,85(2):187-200.

[4] Tacke F, Trautwein C. Mechanisms of liver fibrosis resolution[J]. J Hepatol, 2015,63(4):1038-1039.

[5] 田甜,马国珍,廖志峰,等.Tgf-β1、Pdgf、Ctgf与肝纤维化发病机制的相关性研究进展[J].甘肃医药,2014,33(10):740-742.

[6] Xu W, Wang LW, Shi JZ, et al. Effects of RNA interference targeting transforming growth factor-beta 1 on immune hepatic fibrosis induced by Concanavalin A in mice[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2009,8(3):300-308.

[7] Lang Q, Liu Q, Xu N, et al. The antifibrotic effects of TGF-beta1 siRNA on hepatic fibrosis in rats[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011,409(3):448-453.

[8] 罗海峰,吴志勇,邱江锋,等.特异性siRNA抑制肝星状细胞Smad2表达[J].外科理论与实践,2004,9(4):295-297.

[9] 罗海峰,吴志勇,陈炜,等.Smad2特异性siRNA对大鼠抗肝纤维化的作用[J].上海第二医科大学学报,2005,25(3):256-259.

[10] 赵加斌,赵彬佳惠,唐树尧,等.siRNA对肝纤维化的抑制作用[J].现代生物医学进展,2011,11(22):4328-4330.

[11] 刘晓兵,郭晓红,刘立新,等.siRNA沉默Smad3对肝星状细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究[J].中国病理生理杂志,2011,27(7):1376-1381.

[12] Wang ZR, Wang JH, Hu CL, et al. The effect of down-regulation of Smad3 by RNAi on hepatic stellate cells and a carbon tetrachloride-induced rat model of hepatic fibrosis[J]. Braz J Med Biol Res, 2011,44(2):91-99.

[13] Li G, Xie Q, Shi Y, et al. Inhibition of connective tissue growth factor by siRNA prevents liver fibrosis in rats[J]. J Gene Med, 2006,8(7):889-900.

[14] George J, Tsutsumi M. siRNA-mediated knockdown of connective tissue growth factor prevents N-nitrosodimethylamine-induced hepatic fibrosis in rats[J]. Gene Ther, 2007,14(10):790-803.

[15] Chen L, Charrier AL, Leask A, et al. Ethanol-stimulated differentiated functions of human or mouse hepatic stellate cells are mediated by connective tissue growth factor[J]. J Hepatol, 2011,55(2):399-406.

[16] Hao C, Xie Y, Peng M, et al. Inhibition of connective tissue growth factor suppresses hepatic stellate cell activation in vitro and prevents liver fibrosis in vivo[J]. Clin Exp Med, 2014,14(2):141-150.

[17] Chen SW, Zhang XR, Wang CZ, et al. RNA interference targeting the platelet-derived growth factor receptor beta subunit ameliorates experimental hepatic fibrosis in rats[J]. Liver Int, 2008,28(10):1446-1457.

[18] Chen SW, Chen YX, Zhang XR, et al. Targeted inhibition of platelet-derived growth factor receptor-beta subunit in hepatic stellate cells ameliorates hepatic fibrosis in rats[J]. Gene Ther, 2008,15(21):1424-1435.

[19] Kokkola R, Andersson A, Mullins G, et al. RAGE is the major receptor for the proinflammatory activity of HMGB1 in rodent macrophages[J]. Scand J Immunol, 2005,61(1):1-9.

[20] Ge WS, Wu JX, Fan JG, et al. Inhibition of high-mobility group box 1 expression by siRNA in rat hepatic stellate cells[J]. World J Gastroenterol, 2011,17(36):4090-4098.

[21] Xia JR, Liu NF, Zhu NX. Specific siRNA targeting the receptor for advanced glycation end products inhibits experimental hepatic fibrosis in rats[J]. Int J Mol Sci, 2008,9(4):638-661.

[22] Wang XW, Li WD, Xia JR, et al. Small interfering RNA targeting receptor for advanced glycation end products suppresses the generation of proinflammatory cytokines[J]. Exp Ther Med, 2015,10(2):584-590.

[23] 陈辉,马红.纤溶酶原激活物抑制剂-1与肝纤维化[J].世界华人消化杂志,2011,19(11):1156-1159.

[24] Hu PF, Zhu YW, Zhong W, et al. Inhibition of plasminogen activator inhibitor-1 expression by siRNA in rat hepatic stellate cells[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2008,23(12):1917-1925.

[25] Hu PF, Chen H, Zhong W, et al. Adenovirus-mediated transfer of siRNA against PAI-1 mRNA ameliorates hepatic fibrosis in rats[J]. J Hepatol, 2009,51(1):102-113.

[26] 郭艳祥,杨迎春,李冬梅.MMPs及TIMPs在肝纤维化的作用机制及研究进展[J].贵州医药,2015,39(7):663-665.

国家自然科学基金资助项目(81303112)。

殷子斐(E-mail:yinzifei870730smmu@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.036

R575.2

A

1002-266X(2017)09-0103-04

2016-09-08)