siRNA抑制Caspase-3表达对内毒素诱导肝细胞凋亡的影响

王雪银，宋献美，马云云

(河南医学高等专科学校，郑州451191)

siRNA抑制Caspase-3表达对内毒素诱导肝细胞凋亡的影响

王雪银，宋献美，马云云

(河南医学高等专科学校，郑州451191)

目的观察利用小干扰RNA(siRNA)抑制Caspase-3表达对内毒素诱导肝细胞凋亡的影响。方法针对Caspase-3的DNA序列843～1 634 bp设计引物，常规分子克隆至慢病毒表达载体pLenti-7.1，同时设置空载体为阴性对照；利用Lipofectamine 2000转染至293T细胞，48 h后收获抑制Caspase-3表达病毒质粒V-Caspase-3和空载体病毒质粒V-control。将肝细胞HL7702随机分为观察组和对照组，分别加入V-Caspase-3、V-control培养4 h，均与终浓度为20 mg/L的内毒素共培养12 h。采用Western blotting 法检测Caspase-3蛋白，流式细胞术测算细胞凋亡率，原位末端标记技术测算细胞凋亡指数(AI)，MTT法观察细胞增殖活力。结果观察组HL7702细胞Caspase-3相对表量为17.32±2.16，低于对照组的62.14±4.36(P<0.01)；观察组HL7702细胞凋亡率为28.75%，低于对照组的72.67%(P<0.01)；观察组HL7702细胞AI为23.52±1.24，低于对照组的54.26±1.87(P<0.01)；观察组HL7702细胞增殖率为65.47%±6.24%，高于对照组的41.39%±4.87%(P<0.01)。结论通过siRNA抑制Caspase-3表达能有效降低内毒素诱导的HL7702细胞凋亡，从而增强细胞增殖活性。

小干扰RNA；半胱氨酸蛋白酶3；内毒素；肝细胞；细胞凋亡；细胞增殖

肝衰竭是内毒素血症的一个严重并发症，其发生率高达85%[1]，目前临床缺乏有效治疗措施。内毒素是革兰阴性菌细胞壁外膜的成分，其主要组成部分是脂多糖(LPS)。细菌内毒素可诱导多种细胞凋亡,尤其是肝细胞代谢旺盛时最易损伤[2]。研究证实，Caspase-3 是凋亡过程中最重要的蛋白酶, 是多条凋亡途径的共同下游效应部分，同样也参与了内毒素导致的肝细胞凋亡过程[3,4]。小干扰RNA(siRNA)是对转录后调控最重要的手段，因在体内的转录效率和稳定性不佳而限制了进一步的开发利用[5]。慢病毒由于高效的感染效率和体内外安全性，已成为新的RNA干扰研究工具。2016年5～12月，我们利用慢病毒介导的siRNA抑制内源性的Caspase-3，观察对内毒素所致肝细胞凋亡的影响，为临床治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 正常肝细胞株HL7702、293T细胞由本室保存，siRNA慢病毒表达载体pLenti-7.1及包装载体购自Progema公司，抑制Caspase-3的慢病毒由本室包装保存，Lipofectamine 2000购自Life Technologies公司；Caspase-3一抗、GAPDH抗体购自Abcam公司，原位末端标记技术(TUNEL)试剂盒购自罗氏公司，RIPA裂解缓冲液购自Thermo Fisher Scientific公司,BCA蛋白浓度检测试剂盒购自武汉博士德公司。 RPMI 1640干粉、四氮唑蓝(MTT)购自GIBCO公司，LPS(50 mg/瓶)、降脂烷、SDS-PAGE购自Sigma公司，胎牛血清购自天津TBD公司，胰蛋白酶购自华美生物工程有限公司，二甲基亚砜(DMSO)购自生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 靶向Caspase-3的siRNA序列设计及病毒质粒的制备 利用生物信息学工具选取Caspase-3的DNA序列843～1 634 bp设计引物，上下游引物分别为5′-CGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3′和3′-GAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATG-5′；常规分子克隆至慢病毒表达载体pLenti-7.1，同时设置空载体为阴性对照。利用Lipofectamine 2000转染至293T细胞，48 h后收获抑制Caspase-3表达病毒质粒V-Caspase-3和空载体病毒质粒V-control。

1.2.2 HL7702细胞分组转染与内毒素干扰 取状态良好的HL7702细胞，调整细胞密度为5×105/mL，随机分为观察组和对照组；将细胞接种至12孔板，培养体积为1 mL/孔，置于37 ℃培养箱过夜。取冻存的V-Caspase-3和V-Control，观察组和对照组均滴加滴度为1010的病毒质粒5 μL/孔，37 ℃培养4 h后吸弃培养上清，每孔添加培养基1 mL。两组均添加内毒素使终浓度为20 mg/L，37 ℃培养12 h。

1.2.3 HL7702细胞Caspase-3检测 采用Western blotting 法。取1.2.2中内毒素处理后培养12 h的两组细胞，按照RIPA裂解缓冲液说明提取细胞总蛋白，利用BCA法测定蛋白浓度。取40 μg细胞总蛋白进行12%的SDS-PAGE电泳，常规转膜，抗Caspase-3和GAPDH抗体作为一抗4 ℃孵育过夜；常规二抗室温避光孵育1 h，TBST洗膜3次。采用Odensey激光红外扫描仪检测，以目的蛋白与内参条带的灰度值比值表示蛋白的相对表达量。

1.2.4 HL7702细胞凋亡率测算 采用流式细胞仪。取1.2.2中内毒素处理后培养12 h的两组细胞，进行胰酶消化离心后收集细胞入Eppendorf管；用结合液2 000 μL洗涤1次后,将细胞悬浮于50 μL结合液中；加FITC-Annexin V及PI染液各5 μL，混匀后避光冰浴15 min；结合液洗涤2次后，上流式细胞分析仪检测凋亡细胞，计算细胞凋亡率。

1.2.5 HL7702细胞的凋亡指数(AI)测算 采用TUNEL法。取1.2.2中内毒素处理后培养12 h的两组细胞，以5×105/mL接种于12孔板；将细胞用4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS室温洗3×5 min；每孔细胞滴加TdT标记缓冲液避光室温孵育60 min，用TdT终止缓冲液室温作用5 min，PBS室温洗3×5 min。每孔细胞滴加1 mL的碘化丙啶溶液，室温孵育15 min，PBS清洗3×5 min。吸弃细胞上清，荧光显微镜下被染上荧光的为凋亡细胞,计算各组平均值即为AI。

1.2.6 HL7702细胞增殖能力观察 采用MTT法。 将对数生长期的HL7702细胞随机分为观察组和对照组，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液稀释为8×105/mL，按每孔100 μL接种于96孔板。观察组和对照组分别加入V-Caspase-3和V-Control病毒颗粒0.6 μL/孔,37 ℃培养6 h；两组均添加内毒素使终浓度为20 mg/L，37 ℃培养12 h；每孔添加10 μL MTT(8 mg/mL)，4 h后追加110 μL/孔酸化SDS，12 h后酶联免疫检测仪测A570。细胞增殖率=(1-实验孔A570/对照孔A570)×100%。

2 结果

2.1 两组HL7702细胞Caspase-3表达比较 观察组HL7702细胞Caspase-3相对表量为17.32±2.16，低于对照组的62.14±4.36(P<0.01)。

2.2 两组HL7702细胞凋亡率比较 观察组HL7702细胞凋亡率为28.75%，低于对照组的72.67%(P<0.01)。

2.3 两组HL7702细胞AI比较 观察组HL7702细胞AI为23.52±1.24，低于对照组的54.26±1.87(P<0.01)。

2.4 两组HL7702细胞增殖率比较 观察组HL7702细胞增殖率为65.47%±6.24%，高于对照组的41.39%±4.87%(P<0.01)。

3 讨论

内毒素可以通过细菌裂解或黏附在其他细胞上时释放出来[6]，通过激活线粒体依赖途径和非线粒体依赖途径诱导多种细胞凋亡。肝脏是体内最重要的清除内毒素的器官，同时也最容易受到内毒素攻击而产生损伤。内毒素诱导的肝脏损伤是多种肝病的主要病理基础[7]，可通过引起大量肝细胞凋亡而导致肝衰竭。

细胞凋亡是细胞在一定的环境下，由遗传基因控制的适应性反应,也是保证机体内环境稳定的重要手段[8]。适度的细胞凋亡是生理发育过程中的必要程序，但某些病理条件导致的过度凋亡会引起严重的病理过程[9]。细胞凋亡受到多种因素的调节，肿瘤坏死因子α、转移生长因子、一氧化氮等生物活性介质都能影响细胞凋亡的发生和发展[10]。研究[11]发现，肝细胞大量凋亡是肝衰竭病理过程中的重要事件。早期的研究[12]发现，内毒素可以通过Toll 样受体4激活单核吞噬细胞产生细胞因子导致肝细胞凋亡；另有研究[13]表明，内毒素可以在体外直接诱导肝细胞发生凋亡。我们前期的研究发现，内毒素可以通过激活凋亡受体引起肝细胞凋亡[14]。内毒素诱导肝细胞凋亡的具体机制现在还不清楚，因此临床上仍然缺乏有效的治疗方法。

细胞的凋亡程序一旦启动，胞内的相关凋亡蛋白被激活。Caspase酶家族是凋亡激活过程中最重要的蛋白，其成员包括凋亡起始者Caspase-8、9、10和效应者Caspase-3。Caspase-3是多条细胞凋亡信号的共同下游信号分子，一旦被激活后，可以通过激活一系列的DNA损伤蛋白导致细胞凋亡。我们前期研究也证实，内毒素能够通过激活Caspase-3诱导肝细胞凋亡。因此，干扰内源性Caspase-3的功能，减轻内毒素诱导的肝细胞凋亡有望为肝损伤的临床治疗提供一种新的策略。本研究利用具有高效稳定的慢病毒表达系统成功获得了能够抑制内源性Caspase-3的病毒质粒V-Caspase-3，经一系列的生物化学检测证实抑制内源性Caspase-3后可有效降低内毒素诱导的HL7702细胞凋亡， 减轻内毒素对HL7702细胞增殖活力的影响。因此，抑制内源性Caspase-3表达可以有效减轻内毒素诱导的肝细胞凋亡，我们也将通过动物实验进一步证实此观点，为临床上治疗肝脏损伤提供新的策略。

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Effect of siRNA-induced inhibition of Caspase-3 expression on apoptosis of hepatocytes induced by endotoxin

WANGXueyin,SONGXianmei,MAYunyun

(HenanMedicalCollege,Zhengzhou451191,China)

ObjectiveTo investigate the effect of siRNA-induced inhibition of Caspase-3 expression on the apoptosis of hepatocytes induced by endotoxin.MethodsPrimers were designed for DNA sequence 843-1634 bp of Caspase-3. The target sequences was cloned into the lentivires expression vector pLenti-7.3 and empty lentivirus vector was set as a negative control. The virus vector and empty vector were transfected into 293T cells with Lipofectamine2000 liposomes. The virus of V-caspase-3 and V-control was harvested after 48 h. The hepatocytes HL7702 were randomly divided into the observation group and the control group, which were cultured with V-caspase-3 and V-control for 4 h, and then both groups were cultured with 20 mg/L endotoxin for 12 h. The protein expression of Caspase-3 was detected by Western blotting. The apoptosis rate of HL7702 cells was tested by flow cytometry (FACS). The apoptosis index (AI) was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The proliferative activity of cells was determined by MTT.ResultsThe relative expression of Caspase-3 in HL7702 cells of the observation group was 17.32±2.16, which was lower than that in the control group (62.14±4.36) (P<0.01). The apoptotic rate of HL7702 cells in the observation group was 28.75%, which was lower than that of the control group (72.67%) (P<0.01). The AI of the observation group was 23.52±1.24, which was higher than that of the control group (54.26±1.87) (P<0.01). The proliferation rate of HL7702 cells in the observation group was 65.47%±6.24%, which was higher than that of the control group (41.39%±4.87%) (P<0.01).ConclusionInhibition of caspase-3 by siRNA can effectively decrease the level of apoptosis of endotoxin-induced hepatocytes HL7702, thereby enhance the cell proliferation activity.

small interfering RNA; Caspase-3; endotoxin; hepatocytes; apoptosis; cell proliferation

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.003

R575

A

1002-266X(2017)34-0009-03

2017-05-31)

河南省高等学校重点科研项目计划(15B310006)。

王雪银(1978-)，女，讲师，研究方向为免疫学基础与临床。E-mail: Wangxueyin219@163.com